Рисунки по клеточкам 2019 новые: Рисунки по клеткам могут нарисовать все!

простой рисунки по клеточкам милые маленькие

возможно изначально вам покажется что все так сложно и просто рябит в глазах но как только вы увидите схемы по клеточкам и просто будете считать сколько. новые рисунки по клеточкам 2019 легко и красиво приближается главный праздник года новый год.

Kak Risovat Gamburger Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam

маленькие рисунки по клеточкам в блокноте хорошая идея особенно когда вы находитесь в пути с ребенком и занять его нечем.

простой рисунки по клеточкам милые маленькие. вместо того чтобы рисовать однотипные цветочки на полях своего черновика пока думаешь над решением задачи можно придумать что то интересненькое. рисунки по клеточкам в тетради рисуем легко и красиво. картинки для детей это лучший способ научиться рисовать достаточно посмотреть на них и повторить общие черты.

как рисовать по клеточкам маленькие рисунки. поэтому в первую очередь хочется вам предложить рисунки по клеточкам новогодней тематики. эта идея поможет вашему чаду хорошо провести время.

маленькие и милые животные по клеточкам в тетради сложные новые разноцветные рисунки по клеточкам для 10 лет мороженое еда фрукты и напитки по клеточкам для новичков. рисунки по клеточкам. маленькие рисунки по клеточкам для начинающих рисование по клеточкам можно смело назвать доступным и полезным развлечением как для детей так и для их родителей.

используя простой карандаш и тетрадь в клеточку.

Kak Narisovat Flamingo Risunki Po Kletochkam How To Draw A

How To Draw A Kawaii Heart Risunki Po Kletochkam Kak Risovat

Zajchik Risunki Po Kletochkam Rabbit Pixel Art Risunki

Risunki Po Kletochkam 67 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks

Kak Risovat Milogo Kotenka Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam

Kak Risovat Ponchik Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam Pixelart

Kak Risovat Kavajnoe Oblachko S Radugoj Po Kletochkam Risunki Po

Risovat Po Kletochkam Prostye I Slozhnye Kartinki Shema S

Prostye Risunki Po Kletochkam Dlya Detej 10 Kvadratnyh Zhivotnyh

Risunki Po Kletochkam Raduga S Oblakami How To Draw A Rainbow

Kak Risovat Kavajnyj Arbuz Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam

Kak Risovat Kavajnyj Tropicheskij Koktejl Po Kletochkam Risunki

Kak Risovat Futbolnyj Myach Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam

Kak Risovat Pikachu Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam S

Prostye Risunki Po Kletochkam Dlya Detej 10 Kvadratnyh Zhivotnyh

Kak Risovat Kotenka Risunki Po Kletochkam How To Draw A Cat

Risunki Po Kletochkam Morozhenoe Pixel Art How To Draw A Cute

Kak Risovat Kota Pushin Edinorog Po Kletochkam Risunki Po

Prostye Kartinki Dlya Risovaniya Po Kletochkam With Images

Картинки по клеточкам новые

Категории:

Cерф-шорты Аквапаки Бассейн Баффы Белье 69Slam Вьетнамки Гидроодежда Дайвинг Женская спортивная одежда Кайтсерфинг Камеры GO PRO Коньки Купальники Мужская спортивная одежда Обувь Очки Сноубординг Сумки, рюкзаки, кошельки и бумажники Термобелье Часы

Цвет:

Indian Ornament
Синий
Белый
Розовый
black/cyan
black/white
Red
Black

Слив 20 Туториалов По Скинам Майнрафт Как Нарисовать Красивый Скин Майнкрафт

Слив 20 Туториалов По Скинам Майнрафт Как Нарисовать Красивый Скин Майнкрафт. ????ПАК НА ПК —
????ПАК НА АНДРОИД —

Сперва подпишись на рассылку и тебе выдадут условия, после ты получаешь свои паки в течении 15-20 минут (зависит от загружености, ведь условия проверяет менеджер)
————————————————————————
Надеюсь эти туториалы и паки Вам помогут, в знак благодарности просто влепи лайк и напиши коммент БРО!
————————————————————————
➡️Телеграмм КАНАЛ: ​
➡️ВК: ​

————————————————————————
❤️ Если вам понравилось видео — поставьте лайк!

Если вы на канале впервые, то не забудьте подписаться! ❤️

/>
Теги:
/> флайд, флди, флид, флуд, фладд, flyd, flayd, майнкрафт, minecraft, маинкравт, кубики, скайварс, teroser, виг, артем гуща, туториал, как нарисовать скин майнкрафт, скин, скин майнкрафт, lololoshka, скин, как нарисовать скин, туториал — как нарисовать красивый скин[, как нарисовать, how to draw skin in minecraft, how to draw skin, как нарисовать скин в майнкрафт, тени для скина, тени minecraft, шейд, как научится шейд, туториал по скинам, скин для майнкрафт, тутор по шейду, шейд как у шегги, как рисовать скин, скин для майнкрафта, майнкрафт скин, как нарисовать скин с тенями для майнкрафт, бесплатный скин, нарисовать, как нарисовать скин в minecraft, как нарисовать скин, скины для minecraft, skin, как сделать скин, кириллка, рейл, рейл — майнкрафт, фьюжка, агера, mc skin 3d, paint.net, 2019, 2к19, майнкрафт, скины, майнкрафт скины, скины по никам, скины для вайм ворлд, minecraft скины, топ скинов майнкрафт, запрещенные скины майнкрафт, запрещенные скины, слай, студия слая, slystudio, vimeworld, ваймворлд, вайм, вайм ворлд, майнкрафт сервер, майнкрафт 1.14, бан, бан майнкрафт, стэффи, туториал как нарисовать красивый скин, майнкрафт пе, как нарисовать скин с тенями для майнкрафт, paint.net, фьюжка, мкпе, 2к19, тутор, 2019, скайварс, как нарисовать, как нарисовать скин майнкрафт, агера, терекс, шейд, майнкрафт скины, простые рисунки, туториал как нарисовать красивый скин, рисунки по клеточкам, pixel art, пиксель, pixel, рисуем по клеточкам, hypixel, пикселька, как научится шейд, фуга тв, скин на андроид, скин для майнкрафта, азаазели, монстер, рейт, vimeworld, как рисовать скин, рисунки в тетрадке, рисунки в клетку, рисовать, картинки для срисовки, рейл — майнкрафт, рисунки по клеточкам в тетрадке, кириллка, ваймворлд, туториал по шейду, minecraft skins, рейл, скин minecraft, skins, стеффи, нарисовать, майн, рисунки для детей, скины майнкрафт, pixelart, ревил, фрой, froy, minecraft skin, speed skin, флайд, стрим, что делать на уроке, скинмейкер, бесплатный скин, kawai, кавай скин, выживание, скай варс, тутор по кавай шейду, топ, как сделать скин для майнкрафт, создать скин, вайм, туториал по скинам майнкрафт, топ 3, трофим, как создать скин, майнкрафтер трофим, вайм ворлд, как сделать скрин на компьютере, скин в майнкрафт, как сделать скин minecraft, как создать скин в minecraft, game art, skin minecraft, mine, майнкрафт бедрок, mcskin3d, как, 8 bit, виг, рисунки майнкрафта по клеточкам, пятерка, в майнкрафт, как сделать свой скин в майнкрафте, как сделать скин с тенями, hello pixel art, как сделать скин в майнкрафт, bedwars, skywars, хайпиксель, how to draw skin in minecraft, бедварс, красивый скин, модельки, на телефоне, как поставить скин, гринвикс, minecraft skins for girls, top 5 trending, 10 trending minecraft skins, 3д модельки, 3д скин, мкбе, бредикс, trending minecraft girl skins, minecraft skins download, best minecraft skins 1.14, akirby80, дудл, trending minecraft, akirby80 trending skins, minecraft skins trending, top minecraft skins, akirby80 skins, best minecraft skins, top 10 minecraft skins, trending minecraft skins, 10 minecraft skins, оутро вафи, майнкрафт прохождение карт, компот, грифер, greenwix, бед варс, грин викс, mod’s, mod, [к.э.с]- как сделать собственный скин по нику, триппи туториал, триппи скины майнкрафт, триппи туториалы по скинам

Категория

Разное

Вместе с Слив 20 Туториалов По Скинам Майнрафт Как Нарисовать Красивый Скин Майнкрафт так же смотрят:

Интересные рисунки по клеточкам

Подборка красивых рисунков по клеточкам для начинающих

Все мы художники в душе. И всем нам хочется свой мир разукрасить. А потому рисунки по клеточкам в тетради могут нам в этом помочь. С ними легко можно выполнить сложные и простые рисунки. Понять, как нарисовать сердце по клеточкам, или же, еду, цветы, игривую маму-кошку и ее забияку котенка. А хотите, у вас могут получиться и портреты? Например, есть такие рисунки по клеточкам, фото которых напоминают и изображения людей: мальчика и девочку, все эти разные рисунки несложно освоить. Чтобы понять, как рисовать по клеточкам цветные красивые картинки, стоит познакомиться с техникой нанесения узора по номерам. Увидеть, что есть разные схемы и все они очень легкие, доступные даже новичкам. Ими можно быстро овладеть. Ведь для каждого из нас по небольшим частям воспроизвести нарисованных зверушек, смайлы и сердечки будет не сложно.

И все же, какие есть маленькие и большие, цветные и черно-белые рисунки, выполненные так, чтобы их легко было повторить; и какие перспективы овладеть этой техникой:

• Какие существенные преимущества имеют рисунки по клеточкам для начинающих?
• Тематические рисунки карандашом по клеточкам;
• Область применения таких оригинальных рисунков;
• Какие возможности дают красивые рисунки по небольшим частям.

Самое важное в знакомстве – увидеть, что это подготовленная на нашем сайте для вас коллекция очень красива. И здесь собраны интересные и легкие рисунки. Среди них есть те, которые высоко оценены нашими гостями и давно им знакомы, а есть и новые, любопытные рисунки по клеточкам для личного дневника.Каждый может быть художником! Это заявление абсолютно точно гарантирует, что все наши гости, как только узнают, как научиться рисовать по клеточкам, и смогут скачать на сайте пару-тройку вариантов, красиво все повторят и разукрасят. Для каких бы целей ни служили наши подсказки, например, если это – картинки по клеточкам для девочек 12 лет или рисунки с аппетитной едой, все их можно использовать, чтобы отточить свои художественные способности.Не только образцы готовых открыток у нас есть, но и рисунки по клеточкам: схемы. Такая подсказка, как готовая инструкция поможет двигаться четко по плану, а может быть и в своей, привычной, любимой манере выполнить работу любой сложности. Например, сделать рисунок мороженого по клеточкам, или животных, того же самого котика, или целые композиционные иллюстрации для личного дневника. Не только для давних друзей нашего развлекательного ресурса предоставляется такая возможность, но и новые гости тоже получат шанс обучиться этому искусству, они имеют возможность взять своеобразный мастер класс, урок по изображению всевозможных картинок, на любой вкус и разной сложности. Самое привлекательное, что на сайте есть иллюстрации, интересные, как для девочек, так и для мальчиков. А есть нейтральные темы, к примеру, рисунки по клеточкам еда, а так же, иллюстрации по клеточкам животные: домашние любимцы или лесные зверушки, есть и сказочные, такие, как единорог.Специально, для всех деток, кто любит мультфильм про милых пони и их дружбу, мы подготовили сюрприз! У нас есть картинки по клеточкам пони. Яркие, красочные, они очень привлекательные для деток. А потому мы предлагаем схему, как нарисовать пони по клеточкам. Эта и подобные «инструкции» достаточно понятные и лёгкие даже для ребенка. А главное, они интересные для малышей. Отдельная категория – это рисунки по клеточкам смайлики. Они всегда интересны и всегда актуальны. Они передают настроение и их просто повторить. Для взрослых и детей такая тема именно то, что может подарить радость от плодотворного труда. Удивительно, как часто подобные картинки для выручают нас. Благодаря им можно прекрасно провести время с ребеночком, сколько бы ему не было лет, 5,7 или только год. Мы можем в блокноте делать наброски на скучных совещаниях или в дороге занять себя. А картинки по клеточкам для личного дневника – это вообще незаменимая вещь. А потому, везде и при любых случаях скачивайте или сами нарисуете милые иллюстрации. Всем тем, кто освоил это нехитрое искусство, и знает, как нарисовать по клеточкам котёнка и перед натюрмортом с едой пасовать не станет, мы готовы предложить и более серьезные и интересные варианты. Это могут быть все те же картинки для личного дневника, с подобной тематикой, только более сложные.Сюжет некоторых из них уже передает часть какой-то историей, например, девушка, которая смотрела за котами, которые резвились на полянке. Или же, чёрный и белый квадрат, что составляют сложную композицию, своеобразную голографическую игру. Картинки могут быть больше или меньше по размеру. Основной их цвет – черный, или цветной. Все это разнообразие вариантов исключительно с учетом пожеланий и симпатий наших гостей.

*при копировании материала просим обязательно указывать активную ссылку на источник http://mirpozitiva.ru/

Понравилось? Расскажи друзьям:

mirpozitiva.ru

Рисунки по клеточкам в тетради — как нарисовать красивые и легкие рисунки по клеточкам

Доброго дня!

Предлагаю сегодня заняться творческой деятельностью. Давайте рисовать! Удивлены? А что, проводите весело и задорно свое свободное время. Вот знаете, как примеру его проводят школьники и дошколята? Они открывают тетрадки и рисуют картинки по клеточкам. Как это здорово! Согласитесь? Ведь такая работа развивает усидчивость и логическое мышление, вообщем попробуйте и влюбитесь.

В данной статье, вы найдете картинки (рисунки) от самых простых и легких, к наиболее сложным и трудным. Но их объединяет одно — получаются они очень красивыми. Для начинающих предлагаю сначала брать за основу более легкие фото и по ним творить.

Кстати, психологи уверяют, что такого рода занятие, то есть рисование по клеточкам успокаивает у ребятишек нервную систему, а значит ваш малыш будет здоровым. И не мало важно, если вы педагог то поймете, и орфографическую зоркость. Ведь она нужна, особенно школьникам на уроках русского языка и других предметах, где необходимо повышенная внимательность.

А еще, представляете, такими творческими шедеврами они запросто могут украсить детскую комнату или же личный дневник или еженедельник. Самое главное, что ребенок почувствует себя настоящим волшебником — художником.

Многие, могут спросить, а что собственно можно таким способом рисовать? Ответ прост, рисунки по клеточкам могут передать любой образ, это может быть еда, животные, транспорт, персонажи мультиков и так далее. Плюс еще такие картинки можно разделить как для мальчиков, так и для девочек.

Учителя советуют начинать рисование со смайлов, а вы как считаете? Я думаю, что можно попробовать и начать с чего-то посложнее. Ну, тут конечно нужно смотреть на ваше чадо, смотря какие у него способности. В любом случае поделки, открытки и прочие сувениры делают они с великим удовольствием и поэтому данный вид деятельности их явно заинтересует.

Новые рисунки по клеточкам 2019 для начинающих — легко и красиво

Друзья, перед вами совсем новые картинки, которые вы прямо сейчас можете перенести к себе в блокнотик своим простым карандашом или же берите фломастеры, маркеры. Желаю вам окунуться в этот яркий мир рисунков. Они легкие и такие красивые, что понравятся и мальчикам и девочкам.

Раньше помню в школах, даже на уроках математики делали такие диктанты, помните? Вот инструкция, ух я любила такие ребусы).

Думаю, для начала показать рисунки, которые приурочены к праздникам, таким как Новый год. Это может быть Дед Мороз в виде смайла или снеговик.

Куда же без лесной красавицы — елочки.

А вот смешной Винни-пух в красной шапочке как у Санты.

Еще символы новогоднего настроения, это олененок и пингвин.

А также чудесная рождественская свеча.

А вот теперь рассмотрим валентинки и любовь.

Ну, а за ними придет 23 февраля (кораблики, танки, ну держитесь, мальчишки) и 8 марта (воспользуйтесь шаблонами картинок цветов).

Кстати, знаете, как такой вид деятельности называется? Пикселька! Такое потешное словечко. Это и есть рисование по клеточкам.

Не забывала я и про рисунки на Пасху (это в первую очередь куличи, пасхальные яйца, цыплята) и 9 мая (звезда, танки и гвоздики).

Рисунки по клеточкам в тетради для девочек

Берите эти легкие рисунки и буквально за 5 минут на вашим листе появится веселый и озорной образ. Скоротайте время с пользой, а потом удивите всех. Знаю, что девчонки любят готовить, шить и творить поделки, поэтому картинку подобрала именно такие.

Давайте сначала рассмотрим еду, напитки и сладости, ведь девчата так их любят.

А еще, знаю что любят рисовать единорогов.

И даже есть для срисовки Баттерфляй из мультика о Моя любимая пони.

И вот еще парочка девчачих новинок этого года.

Как нарисовать мальчикам рисунки по клеточкам

А вот мальчики наоборот влюблены в технику, всякого рода машинки, камазы и т.п. Поэтому для них будут именно такие картинки, на тему военной темы и автотраспорта. Также черепашки Нинзя, тачки и многое другое.

Есть и черно-белый вариант.

Как рисовать по клеточкам в тетради маленькие и милые рисунки (можно распечатать бесплатно)

Научиться рисовать будет несложно в любом возрасте. Следуйте пошаговой инструкции и у вас все получится, тем более, что перед вами видео. Вы обязаны его включить и посмотреть от начала до конца. Добавьте пару штрихов от себя, и выйдет очень оригинально.

Ну, а также подготовила вот такие мини заготовки.

Ух, ты-пух ты, кого тут только нет и киска и собачка и даже черепашка! Даже рыбка из мультика.

Как вам такие новенькие идейки? Ну правда великолепны!?

Животные по клеточкам для детей — легко и красиво

Для тех, кто любит милых зверушек, тоже есть подборка, выбирайте любого персонажа и творите. Картинки по клеточкам предложены от самых простых к наиболее сложным.

Берите вот эту потешную собачку.

Или вам больше нравятся кошки или лисички?

Знаю многие обожают мышек и совят.

А малыши цыплят и утят.

Или берите вот этого дельфина.

А вы, друзья кого больше любите, поделитесь внизу под заметкой, возможно добавлю еще персонажей). Ну, а пока ловите веселую и разноцветную зебру и тигра.

Или вот эти герои — панда и енот, с ними еще один чудик. Кто больше нравится?

Картинки по клеточкам для личного дневника

Для тех, кто ведет дневнички или любит рисовать по клеточкам в блокнотах, тому могут пригодится это схемы и готовые шаблоны рисунков. Выбирайте эти няшные работы).

Легкие и красивые рисунки для срисовки по клеточкам (много фотографий внутри)

Ну, а теперь еще подборка довольно необычно красивых и прикольных работ. Подойдут такие рисунки для детей 5-6 лет, то есть для дошколят, а после будут варианты для деток 6-7 лет и 8-10 лет. Вообщем для учеников начальной школы и средней тоже.

Предлагаю рассмотреть картинки на разные времена года, то есть осень-весну, и зиму-лето.

Рисуем по клеточкам сложные картинки для майнкрафта

Для тех, кто увлекается играми, такими как Майнкрафт, то тот наверно захочет воплотить на листе бумаги главных персонажей. Так вот пожалуйста, пользуйтесь.

Ну что ж, друзья, как вам сегодняшняя тема? Вы наверно шокированы, я тоже). В хорошем смысле этого слова. Такие классные и шедевральные картинки могут получиться в тетрадках, всего лишь нужен карандаш и тетрадка и вы уже волшебник. Юный художник, у которого все наверняка получится.

Всем до скорого, увидимся. Пока.

С уважением, Екатерина

page365.ru

Рисунки по клеточкам

Рисунки по клеточкам череп

Коллекция рисунков черепов по клеточкам: страшные и весёлые разноцветные. Вариантов очень много, все зависит от фантазия рисующего.

Косичка рисунок по клеточкам

Дети часто украшают свои тетради в клеточку различными рисунками. Это могут быть переплетенные цветные косички, орнаменты,

3д рисунки по клеточкам

Объемные рисунки заставляют взглянуть на творчество совершенно по-новому. Нарисовать 3Д-рисунок на бумаге сможет каждый, если приложить немного

Имена по клеточкам

Предлагаем разнообразные картинки с именами по клеточка. Если найти собственное имя не удается, используйте примеры, чтобы написать

Девочки по клеточкам

Рисунки девочки по клеточкам — от простых до самых сложных. Рисуйте в по клеточкам в тетради,

Панда рисунок по клеточкам

Подборка милых панд по клеточкам. Озорные весёлые, неуклюжие, задумчивые панды займут достойное место в тетради по рисованию. Вот несколько

Андертейл рисунки по клеточкам

Если Вам нравится игра Андертейл, попробуйте нарисовать виртуальные образы героев и предметов по клеточкам, для срисовки, возьмите в

Рисунки по клеточкам Покемоны

Предлагаем интересную и красивую подборку рисунков — Покемоны по клеточкам. Покемы — удивительные и забавные создания, которые могут

Рисунки по клеточкам Пицца

Нарисовать любимую пиццу по клеточкам – очень просто. Достаточно выбрать образец для перерисовки, подобрать подходящие по

Симпсоны по клеточкам

Подборка для рисунков по клеточкам Симпсонов — то, что нужно поклонникам знаменитого мультсериала. Станьте счастливым обладателем

Гравити Фолз по клеточкам

Предлагаем уникальную подборку изображений по клеточкам Гравити Фолз. Рисуйте своих любимых героев прямо в тетради или

Фнаф рисунки по клеточкам

Предлагаем вам коллекцию Фнаф рисунков по клеточкам, в которых вы можете изобразить своих любимых героев мультфильма.

Пикачу по клеточкам

Предлагаем ознакомиться с веселой подборкой картинок пикачу по клеточкам, с помощью которой вы можете нарисовать знаменитого

Маленькие рисунки по клеточкам

Подборка забавных маленьких рисунков по клеточкам дает огромное пространство для творческих идей. Хобби развивает моторику рук

Скрасить скучные моменты помогут вам рисунки по клеточкам. Для такого вида рисования не нужна никакая предварительная подготовка. Просто возьмите понравившийся образец и перенесите его в клетчатую тетрадь. Даже те, кто вовсе не наделен даром рисования, способен создать великолепные рисунки собственноручно. Воспользовавшись нашими шаблонами и подсказками, вы прекрасно проведете время.

Рисовать рисунки по клеткам в тетради: польза для детей

С взрослыми все ясно: рисование по клеточкам позволяет приятно провести время и занять себя. Такое интересное дело заставляет творчески мыслить, развивает координацию, а также прекрасно успокаивает. Детям же это удовольствие приносит еще больше пользы:

• Развивает воображение и мышление.
• Тренирует мелкую моторику рук.
• Формирует орфографическую зоркость.
• Позволяет производить стратегию действий.
• Дает навыки по рисованию, с которыми можно будет приступать к более сложным рисункам в дальнейшем.
• Успокаивает нервную систему, устраняет излишнюю раздражительность, подавляет гиперактивность. Поверьте, это гораздо полезнее сидения за гаджетами сутками напролет.
• Помогает справиться с непоседливостью и невнимательностью.
• Развивает более точную координацию движений.

Как легко рисовать по клеточкам?

Для этого вида рисунка возьмите обычную тетрадь в клетку. Если схемы большие, то запаситесь полотном в клетку формата А4 или миллиметровой бумагой.

Для заливки воспользуйтесь:

• ручками;
• карандашами;
• фломастерами;
• разноцветным мелом.

Все зависит от вида рисунка: он может быть ярким и красочным, а может быть выполнен только простым карандашом. В конце рисования каждую часть рисунка, или же ячейку можно обвести по контуру черным цветом. Вот так запросто можно создать настоящую красоту, требующую минимум усилий.

Кстати, рисование по клеточкам происходит от старорусского занятия – вышивки крестом. Так что нарисованы схемы можно еще и вышить.

Простые рисунки по клеточкам в тетради для начинающих

На нашем сайте представлены подборки рисунков по клеточкам различной категории сложности. Даже начинающий «художник» сможет воплотить в реальность свои замыслы, что уж говорить о творческих людях! Попробуйте реализовать сначала маленькие рисуночки, а потом запросто берите образцы сложнее. Такой вид рисунка подойдет детям, даже тем, чья фантазия не слишком развита для обычного рисунка.

Здесь вы сможете найти очень много вариантов рисунков – начните с простых. Их выполнение займет не больше четверти часа, но вы все же получите определенный навык. Вообще, говоря, об уровне сложности подобного рисунка, не нужно бояться браться за сложную композицию. Просто для выполнения сложного рисунка понадобится больше времени, а для простого – меньше. Но даже новичок способен воплотить вживую сложный рисунок по клеточкам с первого раза.

kartinki-dlya-srisovki.ru

Картинки для рисунков по клеточкам в тетради: легкие и маленькие, но красивые

Хотите научиться классно рисовать? Начните с самого простого — с картинок по клеточкам. С этим справится не только взрослый, но и даже школьник.

Это занятие приносит удовольствие, позволяет избавиться от стресса и нервного напряжения, а также развивает внимательность и способность стратегически мыслить!

Как нарисовать такую картинку? Все, что вам для этого понадобится — это тетрадь в клеточку, ручка, карандаши или фломастеры (на ваше усмотрение).

Все рисунки можно делать как в тетради, так и на отдельных листках в клетку.

Ну что, начнем?

Легкие картинки для старта

В этом подразделе вы увидите самые легкие картинки для старта!

Пикачу

Бокал

Смайл

Попугай

Розовый мишка

Мопс

Красивые изображения

В этом подразделе собраны красивые изображения на любой вкус.

Лицо

Аниме

Птица

Дракон

Рыба

Радужный глаз

Еще одна рыбка

Туфельки

Кекс

Подборка для начинающих

Небольшая подборка картинок по клеточкам для начинающих.

Кот

Черепаха

Подсолнух

Микки Маус

Радуга

Сердечки

Маленькие изображения

Если у вас немного времени, но хочется порисовать, то вы можете выбрать маленькие изображения из этой подборки.

Соска

Котенок

Кот Саймон

Котик

Елка

Лисенок

Хотите увидеть, как выглядят уже нарисованные картинки? Взгляните на это видео!

Если вы вдохновились нашими идеями, то скорее хватайте карандаши с фломастерами и начинайте творить!

bestcube.space

Картинки для срисовки по клеточкам: красивые, интересные, легкие и сложные рисунки в тетрадь

Большую популярность в последнее время набирает рисование по клеткам. Чтобы вы всегда знали, что нарисовать и часами не искали новые идеи, мы приготовили картинки для срисовки по клеточкам. Раньше такие изображения чаще встречались в схемах для вышивки, а сейчас украшают тетради для рисования. Эти «пиксельные» изображения стали востребованы как у детей, так и у взрослых. С помощью пикселей создаются интересные картины с символами, животными, предметами и людьми.

Содержание

• 1 Рисунки по клеточкам
• 2 Легкие рисунки по клеточкам

Рисунки по клеточкам

Срисовывать рисунки по клеточкам не сложно. Так как все представленные картинки черно-белые, вам понадобится простой карандаш и тетрадь или листик в клетку. Затем выбирайте любой понравившийся рисунок, внимательно на него смотрите и начинайте поэтапно срисовывать.

Рисунки для срисовки по клеткам, которые мы отобрали очень разные. Среди них много животных, мультяшных персонажей и даже портрет. И если вам сложно представить, как это выглядит нарисованным по клеточкам, посмотрите на эти красивые картинки и убедитесь, что весьма оригинально и необычно.

Нарисованные картинки по клеточкам украсят ваши тетради и превратят их в художественные альбомы, главное не рисуйте в школьных тетрадях и на уроках, учителя не оценят вашу тягу к прекрасному.

Рисуя красивые рисунки по клеточкам с детьми, вы будете развивать у ребенка логическое мышление, внимание и аккуратность. А заодно и математику захватите, высчитывая где и в какой строке нужно рисовать.

На первый взгляд кажется, что все очень просто, считай, да рисуй. Так и есть, только нужно проявлять аккуратность и следовать строго по схеме. Упустив или переместив один квадратик, может потеряться правильность всего изображения.

Легкие рисунки по клеточкам

Для начинающих kakrisovat.com подготовил самые простые рисунки карандашом для срисовки по клеточкам. Они очень легкие и содержат в себе лишь контур изображения. Поэтому вы точно сможете нарисовать их, а потом перейти к более сложным рисункам.

Здесь главное понять принцип и сразу не запутаться в большом количестве квадратиков. Тогда срисовки пойдут легко, будете создавать несколько за один вечер. Конечно первое время вы можете постоянно искать для срисовки карандашом легкие картинки и только когда будете уверенны в себе на все сто, перейдете на сложные в перерисовывании изображения.

Мы собрали картинки разной сложности, так что вам будет куда расти и развиваться. Можете выбрать любой рисунок и проверить свои силы художника уже сейчас. Запасайтесь тетрадями, карандашами, ластиком и точилкой, мы знаем, что вас затянет и остановится будет трудно.

kakrisovat.com

Рисунки по клеточкам

Художественное искусство это не только полёт фантазии, но и чистой воды математика. Точный визуальный расчёт поможет нарисовать любой рисунок. При любом размещении клеток рисунка необходимо учитывать математические закономерности картинки. Рисунки по клеточкам помогут добиться точности в рисовании, познакомить с правилами рисования по клеткам на практике.

Раскрой теорию рисования в действии. Возьми лист бумаги и карандаш. Начинай рисовать рисунки по клеточкам, используя в качестве обучающего материала картинки-примерники с нашего сайта. Выбирай любую тему и копируй рисунки в свою тетрадь. Не отступай от схемы и будь внимательнее при подсчёте клеток.

Начинать обучение художественному мастерству можно самостоятельно. Все великие живописцы начинали свой творческий путь с копирования работ других авторов. Изучив азы, можно начинать собственные эксперименты в искусстве — знакомиться с основными правилами, набивать руку на готовых работах, срисовывая. Начните с раздела…

В преддверии праздников всегда появляется желание творить. Создать своими руками красивую открытку, плакат с пожеланиями будет несложно, если вы освоите технику рисования по клеткам. Для этого потребуется тетрадь, карандаши и настойчивость. Выбирайте рисунки по клеточкам на Новый год. В этих…

Холодным зимним днём и в летнюю жару вам не придётся скучать, если под рукой окажется тетрадь и цветные карандаши. Рисование позволит забыть о капризах погоды. Для срисовывания вам потребуются рисунки по клеткам лёгкие и красивые. С их помощью вы интересно…

Если вам по душе рисовать цветными карандашами, фломастерами или гелиевыми ручками, выбирайте большие рисунки по клеточкам. Вашим пальчикам предстоит потрудиться. Проявите терпение и внимательность. Основное правило – не нужно торопиться, не забывайте о внимательности. Отсчитывайте указанное число клеточек и закрашивайте…

Юные леди с удовольствием занимаются творчеством. Цветные карандаши не лежат у них без дела. Они ведут личные дневники, обязательным элементом которых являются красивые рисунки, оригинальные рамки, удивительно прекрасные идеи для иллюстраций и оформлений. Если есть желание заняться творчеством, выбирайте рисунки…

Рисование отлично развивает мелкую моторику пальцев, что положительно влияет на каллиграфию. Именно поэтому детям необходимо почаще браться за карандаши и фломастеры. Если самостоятельно придумать тему для рисования не получается, заходите на наш сайт и вдохновляйтесь готовыми для срисовывания работами. Мы…

В детском саду и в школе детей обязательно учат рисовать окружающий мир. Это помогает быстрее запоминать названия предметов и формирует образное мышление. Не упускайте шанс помочь ребёнку в развитии художественных талантов и желании познать мир. Откройте раздел сайта рисунки по…

Роза – красивый и впечатляющий своим величием цветок. Научитесь изображать её в своей тетради и в любой момент сможете порадовать родных и друзей оригинальным подарком. Рисунки по клеточкам роза, внимательно рассмотрите картинки в галерее нашего сайта. Найдите то изображение розы,…

Никогда не поздно научиться рисовать. Художественное мастерство позволяет расслабиться и дать волю фантазии. Если вы любите живую природу и с удовольствием рисуете в тетрадном листе, значит, настало время совершенствовать свой талант. Рассмотрите как нарисовать розу по клеточкам, выбирайте понравившийся формат…

Создавать неповторимые орнаменты на бумаге помогут рисунки по клеточкам цветы. Нарисованные растительные мотивы могут стать отличной темой для поздравительной открытки или пригласительного. Розы, тюльпаны, лилии и другие цветы, собранные в панно или витиеватый орнамент будут радовать глаз и дарить прекрасное…

risujte.ru

Удаление фона рисунка

1. Выберите рисунок, фон на который вы хотите удалить.

2. Выберите «Формат рисунка> удалить фон или> «Удалить фон».

   Если вы не видите «Удалить фон»,убедитесь, что выбрали рисунок. Возможно, понадобится дважды щелкнуть изображение, чтобы выбрать и открыть его на вкладка Формат.

3. По умолчанию область фона будет закрашена пурпурным (что показывает, что ее можно удалить), а изображение на переднем плане сохранит естественные цвета.

4. Если область по умолчанию неправиляция, перейдите в > «Средства для работы с рисунками» и сделайте следующее:

   • Если фрагменты рисунка, который вы хотите сохранить, являются пурпурными (помечены для удаления), выберите «Пометить области для сохраняемого» и карандашом в виде пометить области на рисунке, которые нужно сохранить.

   • Чтобы удалить дополнительные части рисунка, выберите «Пометить области для удаления» и пометить их с помощью карандаша.

5. Когда все будет готово, выберите «Сохранить изменения» или «Отменить все изменения».

   Чтобы сохранить изображение в отдельном файле для использования в дальнейшем, щелкните его правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить как рисунок».

К рисунку, оставшемуся после удаления фона, можно применить художественный эффект или добавить к рисунку эффекты.

1. Выберите рисунок, фон на который вы хотите удалить.

2. В группе «Средства работы с рисунками» на вкладке «Формат» в группе «Настройка» выберите «Удалить фон».

3. Щелкните один из маркеров линий области выделения, а затем перетащите линию таким образом, чтобы область содержала часть рисунка, которую необходимо сохранить, и не содержала большую часть областей, которые нужно удалить.

   Иногда вы можете получить нужный результат, не поэкспериментируйте с положением линий области и размером области.

   Совет: Чтобы отменить пометки областей, выберите «Удалить пометку», а затем выберите линию.

4. Если область по умолчанию неправиляция, перейдите в > «Средства для работы с рисунками» и сделайте следующее:

   • Выберите «Пометить области для сохраняемой области» карандашом, чтобы пометить области на рисунке, которые нужно сохранить.

   • Выберите «Пометить области для удаления» и карандашом , чтобы пометить их.

5. Когда все будет готово, выберите «Сохранить изменения» или «Отменить все изменения».

   Чтобы сохранить изображение в отдельном файле для использования в дальнейшем, щелкните его правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить как рисунок».

К рисунку, оставшемуся после удаления фона, можно применить художественный эффект или добавить к рисунку эффекты.

Клиника ЭКО «Геном-Астана» | Центр ЭКО и репродуктивных технологий в Астане: лечение бесплодия, сделать ИКСИ, суррогатное материнство, искусственная инсеминация

«Одна попытка ЭКО – один здоровый малыш». Чтобы добиться такого результата, специалисты клиники «Геном-Астана» проводят лечение бесплодия с применением самых передовых методов. Прежде всего, это вспомогательные репродуктивные технологии – ЭКО, ИКСИ, ПИКСИ, вспомогательный хетчинг, криоконсервация (витрификация), преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ), искусственная активация яйцеклеток методом ионофора кальция, использование среды EmbryoGlue® при переносе эмбрионов. Здесь предлагается услуга «Суррогатное материнство», проводится ЭКО с донорскими ооцитами, эмбрионами, спермой.

Диагностика бесплодия в центре планирования семьи «Геном-Астана» включает УЗИ, лабораторные анализы, кольпоскопию. Женщине по показаниям может быть назначена гистероскопия для выявления внутриматочной патологии.

Диагностика мужского бесплодия обязательно включает анализ спермы — спермограмму. Расширенная спермограмма включает такие исследования как определение фрагментации ДНК сперматозоидов, наличия в эякуляте антиспермальных антител. Кроме того, оценивается внешнее строение сперматозоидов, степень их зрелости (HBA-тест), подвижность (кинезиограмма), жизнеспособность (тест на витальность). Если имеет место азооспермия или непроходимость семявыводящих путей, то сперматозоидов в сперме не будет. Сегодня данная проблема решаема — их можно получить из яичка или придатка с помощью технологий TESA, PESA. В случае серьёзного нарушения сперматогенеза, когда сперматозоиды не образуются, применяется донорская сперма.

Центр ЭКО «Геном» в Астане (Нур-Султан) предлагает комплекс услуг для беременных – это программы ведения беременности естественной и после ЭКО, а также неинвазивные пренатальные исследования. Они позволяют определить наличие у плода генетических патологий, пол ребёнка и резус-фактор для профилактики резус-конфликта.

В клинике репродукции «Геном» (Genom) ведут приём репродуктологи, акушеры-гинекологи, эндокринолог, терапевт, кардиолог, гематолог, генетик, онколог-маммолог. По вопросам эмбриологического этапа ЭКО можно получить консультацию эмбриолога.

Наши специалисты помогают преодолеть Бесплодие различных форм и видов (первичное, вторичное, эндокринное, иммуннологическое, генетическое, неясного генеза, обусловленного аномалиями развития половых органов, возрастным фактором, а также гинекологическими и урологическими заболеваниями). Благодаря усилиям команды «Геном-Астана» сотни мужчин и женщин стали счастливыми родителями. Многие готовятся ими стать. А кто-то сделал первый верный шаг – позвонил и записался на приём к репродуктологу.

Большой мозг нужен китам для обогрева?

Китообразные — киты, дельфины и морские свиньи — уникальная группа млекопитающих, выделяющаяся, среди прочего, необычно крупным мозгом. Ученые выяснили, что в митохондриях клеток мозга этих животных присутствуют белки-разобщители, которые обеспечивают превращение энергии окисления органических веществ непосредственно в тепло — вместо того, чтобы использовать эту энергию на синтез АТФ. Особенно много клеток с белками-разобщителями оказалось в сером веществе коры головного мозга. Эти же белки работают в бурой жировой ткани у многих животных, особенно у обитающих в холодных регионах. Известно, что выделение тепла активируется в буром жире под действием норадреналина. И опять-таки в коре головного мозга китов (а особенно — в сером веществе коры) обнаружилось повышенное количество норадренергических синапсов. Эти данные авторы используют в качестве аргумента в защиту любопытной гипотезы: возможно, большой мозг развился у этих животных не для того, чтобы решать сложные задачи, а для того, чтобы генерировать тепло и сохранять постоянство собственной температуры.

Китообразные (группа животных, включающая в себя китов, морских свиней и дельфинов) сильно выделяются среди всех млекопитающих, во-первых, своей необычной адаптацией к полностью водному образу жизни (история их перехода с суши в воду подробно описана в статье Михаила Гельфанда Молекулярная эволюция: как киты уходили под воду), а во-вторых, удивительно большим мозгом, причем как в абсолютном выражении, так и в относительном (по отношению массы мозга к массе тела). Единственным видом, у которого относительная масса мозга выше, чем у китов и дельфинов, является человек.

Следует понимать, что большой мозг — это роскошь, которую не все могут себе позволить. Нейроны головного мозга — самые дорогостоящие клетки в смысле энергетических потребностей. Так что эволюционный рост мозга должен быть оправдан какими-то серьезными адаптивными преимуществами, которые бы перекрывали собой ущерб, связанный с необходимостью кормить эту прожорливую клеточную массу.

Вот уже более 20 лет двое ученых — исследовательница из США Лори Марино (Lori Marino) и ученый из Витватерсрандского университета в ЮАР Пол Мейнджер (Paul Manger), каждый из которых связал свою жизнь с нейробиологией (и оба руководят большими исследовательскими группами), — публично дискутируют друг с другом, отстаивая альтернативные интерпретации адаптивного значения эволюции размеров мозга. Особенно острым в этой дискуссии является вопрос эволюции и функционального значения большого мозга китообразных.

Принято связывать увеличение мозга с совершенствованием интеллекта и способностей эффективно решать более сложные и разнообразные задачи в контексте взаимодействия животных с внешней средой и друг с другом. Предполагается, что в эволюции размера мозга действует положительная обратная связь: рост мозга способствует усложнению поведения, в том числе социального и орудийного, возникновению «культуры» (формированию и распространению новых выученных форм поведения в социальной группе), что, в свою очередь, создает предпосылку для отбора на дальнейшее увеличение размеров мозга.

Именно так интерпретируется ход эволюции человека и это же объяснение вполне может быть применимо к другим группам животных, выделяющихся необычно высокими размерами мозга — таким как киты и дельфины. И как раз такую позицию последовательно отстаивает Лори Марино — авторитетная исследовательница в области эволюции, мозга, поведения и когнитивных способностей китообразных. Кстати, именно она в 2001 году впервые продемонстрировала способность дельфинов узнавать себя в зеркале. Лори Марино также является основателем и директором центра защиты животных (The Kimmela center for animal advocacy).

Пол Мейнджер, специалист по анатомии мозга, руководитель лаборатории в Витватерсрандском университете (Йоханнесбург, ЮАР), еще в 2006 году предложил рассмотреть альтернативную гипотезу, предположив, что рост мозга в эволюции китообразных был связан с потребностями терморегуляции, необходимой для адаптации к жизни в холодной воде, а вовсе не в связи с развитием когнитивных способностей (P. Manger, 2006. An examination of cetacean brain structure with a novel hypothesis correlating thermogenesis to the evolution of a big brain).

В этой новости мы поговорим о новой работе Пола Мейнджера и его коллег, в которой приводятся новые данные в пользу обозначенной выше гипотезы. Кроме Мейнджера в списке авторов представлены ученые из очень разных и далеких друг от друга стран: США, Дании, Швеции, Исландии, Саудовской Аравии и Японии.

Итак, проследуем за учеными в их рассуждениях.

Часть аргументов были собраны в упомянутой выше публикации Мейнджера 2006 года — авторы напоминают их во введении к своей статье. Они касаются анатомических характеристик мозга китов, особенностей поведения, данных палеонтологии, палеоклиматологии и зоогеографии.

Начнем с анатомии. Мейнджер указывает на большое число специфических особенностей анатомии мозга китообразных в сравнении с другими млекопитающими (в частности, с приматами). Первым делом бросается в глаза очень высокая складчатость коры головного мозга, и, как следствие, необычайно большая площадь ее поверхности (это хорошо видно на рис. 1). И вместе с тем кора головного мозга китообразных довольно тонкая, а также характеризуется сниженной плотностью нейронов и сниженным отношением количества серого вещества к белому веществу в сравнении со многими другими млекопитающими. Серое вещество образовано телами нейронов, а белое — нервными волокнами и клетками глии (вспомогательными не нейрональными клетками).

Мейнджер также указывает на более простое строение коры головного мозга китов: у большинства млекопитающих кора образована преимущественно шестью клеточными слоями, каждый из которых имеет специфические структурные особенности, у китов же слой IV (слой гранулярных клеток) отсутствует, снижено общее количество нейрональных морфотипов, в ней слабо выражена организация в колонки. Выделяется меньшее число специализированных зон коры головного мозга, относительно малы размеры префронтальной и височной коры. Есть особенности и в других отделах мозга. Так, у китов относительно небольшой размер гиппокампа (это структура, которая считается ключевой для формирования долговременной памяти). В гиппокампе взрослых китообразных не выявлен нейрогенез, который у других млекопитающих, как предполагается, важен для эффективной работы механизмов памяти и обучения в течение жизни. Также пропорционально малы размеры мозолистого тела — той области, где проходят нейрональные связи между левым и правым полушариями мозга. Мейнджер заключает, что при действительно наблюдаемом росте количества мозговой ткани, в эволюции китов не наблюдалось качественного совершенствования структуры мозга, в отличие от того, что имело место в ходе эволюции главных наземных интеллектуалов — приматов.

Что касается поведения, Мейнджер считает принятые оценки интеллекта китов и дельфинов сильно завышенными. В своих рассуждениях он указывает на то, что так или иначе любой компонент «интеллекта» дельфинов, оцениваемый при помощи разнообразных специально разработанных тестов, можно обнаружить у других видов животных, имеющих при этом вовсе не такие выдающиеся размерные показатели мозга (Лори Марино, однако, с этим утверждением категорически не согласна, см., например, ее статью L. Marino, 2002. Convergence of complex cognitive abilities in cetaceans and primates). С другой стороны, уникальной особенностью поведения китообразных является их сон — «спит» почти всегда только одно полушарие мозга, в то время как второе «бодрствует». К тому же исследования, проводившиеся на дельфинах, привели к выводу, что у этих животных нет фазы быстрого сна. Также было установлено, что температура спящего полушария мозга постепенно снижается, тогда как бодрствующее полушарие сохраняет постоянную высокую температуру. Все эти необычные свойства сна китообразных подробно описаны в статье O. Lyamin et al., 2008. Cetacean sleep: An unusual form of mammalian sleep, в число соавторов которой входит Мейнджер. Впрочем, однополушарный сон китов и дельфинов часто объясняют необходимостью постоянного контроля за процессом дыхания, ведь, чтобы сделать выдох и вдох, этим животным требуется всплыть к поверхности воды.

Все указанные особенности анатомии и сна китообразных, как полагает Мейнджер, хорошо объясняются именно с позиции предположения о важнейшем значении терморегуляторной функции, выполняемой мозгом китов.

Следующая группа аргументов опирается на данные палеонтологии и палеоклиматологии. Палеонтологическая история китообразных изучена весьма подробно (см. обзор А. Лопатина Эволюционная история китообразных: морское путешествие продолжительностью 55 миллионов лет). Возрастом 55 миллионов лет датируется пакицет — самое раннее известное переходное звено между наземными парнокопытными и собственно водоплавающими китообразными (на происхождение китообразных от древних парнокопытных указывает молекулярная филогенетика). Ряд черт анатомии этого вида указывает на начало адаптации к полуводному образу жизни. Далее следует череда ископаемых видов, все более и более адаптированных к постоянному водному образу жизни. Весь этот переход занял около 8 миллионов лет.

Однако мозг археоцетов, древних китов, очень долго, в течение 20 миллионов лет, оставался на удивление маленьким — площадь его поверхности не превосходила 50 см² (сравните с 1500–14000 см² у современных представителей). Стремительный рост мозга китов начался около 34–30 миллионов лет назад, и продолжался вплоть до конца миоцена. По времени это совпадает с началом значительного похолодания климата и снижения температуры вод мирового океана (именно в этот промежуток времени произошло замерзание Антарктиды, а затем и Арктики). По крайней мере, абсолютный размер мозга увеличивался почти у всех китообразных, хотя у некоторых из них, начавших стремительно увеличивать общий размер тела, относительный размер мозга мог и уменьшаться.

На рис. 2 наглядно показан ход истории изменения размерных параметров тела и мозга в разных ветвях китообразных. По мнению Лори Марино похолодание могло изменить экосистемы так, что древним китам стало сложнее добывать привычную им добычу (S. Montgomery et al., 2013. The evolutionary history of cetacean brain and body size). Необходимость решить эту задачу подтолкнуло к выработке новых стратегий охоты, в том числе таких, которые задействовали координированные действия нескольких особей. То есть киты начали превращаться в социальных животных, а социальность, как мы видим на примере многих групп животных, создает вектор отбора на увеличение мозга в связи с совершенствованием когнитивных способностей, важных для эффективного социального взаимодействия. В этом сценарии мозг и поведение начинают эволюционировать в режиме положительной обратной связи: усложнение поведения создает вектор эволюции на усложнение мозга, а усложнение мозга в свою очередь позволяет появляться еще более сложным формам поведения. Пол Мейнджер, однако, полагает, что в случае с китами увеличение мозга в ответ на похолодание имеет куда более прозаическое объяснение — это просто то решение, которое нашла эволюция, чтобы сохранить необходимое тепло в голове животных.

Сравнивая размеры мозга у современных китообразных между собой, Мейнджер опять-таки выявил корреляцию относительного размера мозга с температурой вод в зоне обитания каждого вида (P. Manger, 2006. An examination of cetacean brain structure with a novel hypothesis correlating thermogenesis to the evolution of a big brain). Это уже аргументация с точки зрения зоогеографии.

В новом исследовании авторы изучали биохимические характеристики тканей мозга китов, добавив, как они считают, новые аргументы в пользу «температурной» гипотезы Мейнджера.

Мозг млекопитающих очень чувствителен к охлаждению. К примеру, эксперименты на морских свинках показали, что при охлаждении мозга до 25–26°C с оптимальной для этих животных температуры 37°C нейроны почти полностью теряли способность генерировать нервные импульсы (Y. Mednikova et al., 2004. Effects of temperature on the spike activity of cortical neurons in guinea pigs). Так что наличие механизмов, препятствующих переохлаждению мозга при обитании в холодной воде, действительно критически необходимо.

Известно, что в геномах млекопитающих существует группа генов UCP (от англ. uncoupling protein — разобщающий белок). Эти гены кодируют белки, которые могут встраиваться во внутреннюю мембрану митохондрий и работать в качестве протонных каналов.

Митохондрии по большей части занимаются продукцией АТФ (аденозинтрифосфата) — молекул, которые обеспечивают энергетическое снабжение для большинства энергозатратных биохимических реакций в живых клетках. На внутренней мембране митохондрий работает электрон-транспортная цепь, создающая градиент протонов (H⁺) с двух сторон от этой мембраны — снаружи больше, изнутри меньше. Кроме того, в мембране есть особый белковый комплекс, образующий протонный канал. В этом же комплексе присутствует и фермент АТФ-синтаза, который синтезирует АТФ, — для такого синтеза используется энергия, выделяющаяся при транспортировке протонов через протонный канал с внешней стороны мембраны к внутренней ее стороне. То есть транспорт протонов оказывается сопряжен с синтезом АТФ.

Однако, когда в мембране митохондрии присутствуют белки UCP, транспортировка протонов не сопровождается синтезом АТФ, — вот потому-то их и называют разобщителями. Но выделяемая энергия должна перейти в какую-то форму. Раз не в синтез АТФ, то, очевидно, в тепло. В этом и состоит функция белков-разобщителей. Клеткам нужны молекулы АТФ — они расходуются во многих важных внутриклеточных процессах. Поэтому в большинстве митохондрий белков UCP нет. В наибольшем количестве эти белки обнаруживаются в митохондриях особой разновидности жировой ткани — буром жире. Эта ткань есть у млекопитающих, которые обитают в холодном климате, у млекопитающих, которые легко теряют тепло из-за мелких размеров тела, а, к примеру, у человека немного бурого жира можно найти у младенцев, с возрастом же эта ткань атрофируется полностью или почти полностью. У взрослых тепло в основном генерируют мышцы. Но в черепной коробке нет мышц, а поддерживать температуру все же надо — значит должен быть какой-то автономный механизм. И действительно, в мозге человека, как выяснилось, тоже присутствуют белки UCP.

Кодируются эти белки у млекопитающих пятью паралогичными генами. Продукты по крайней мере трех из них (UCP1, UCP4 и UCP5) были выявлены в тканях мозга. Ученые решили проверить, как обстоит дело с экспрессией этих генов в тканях мозга китообразных и у их ближайших родственников — парнокопытных.

Материалом исследования послужили ткани мозга 11 парнокопытных (по одной особи одиннадцати разных видов) и 5 китообразных (трех разных видов: морской свиньи Phocoena phocoena, малого полосатика Balaenoptera acutorostrata и горбатого кита Megaptera novaeangliae).

Для начала провели подсчет количества клеток — нейронов и клеток глии. В коре головного мозга всех трех видов китообразных оказалась более низкая плотность по количеству нейронов на единицу объема и более высокая доля клеток глии по сравнению с теми же показателями у парнокопытных.

Анализ РНК показал экспрессию всех генов UCP в мозге как у парнокопытных, так и у китообразных. Но присутствие РНК не всегда обозначает наличие конечного продукта — собственно белка. Для выявления белков в митохондриях клеток мозга использовали иммуноокрашивание с использованием специфичных антител. В нейронах коры головного мозга у всех проверенных видов обнаружился белок UCP1. Но у парнокопытных он был только в нейронах слоев III, IV и V, а у китообразных — по всей толщине коры. Количественно у парнокопытных белок UCP1 содержали в среднем 35,4% клеток (с разбросом от 11 до 58%), а у китообразных — 74,6% (причем у дельфина и горбатого кита окрашивались все 100% клеток). Пример фотографии окрашенных тканей приведен на рис. 3, а результаты количественного учета — на рис. 4.

В клетках глии (но не в нейронах) обнаружились белки UCP4 и UCP5. Причем, иммуноокрашивание на эти белки (более яркое для UCP4) наблюдалось исключительно в тканях китообразных. В сером веществе коры головного мозга окрашивалось в среднем 36% клеток глии, а в белом веществе мозга — 56% глиальных клеток. У парнокопытных, несмотря на то, что присутствие мРНК и самих белков UCP в тканях их мозга было показано другими методами, количество этих молекул оказалось настолько низким, что при иммуноокрашивании их совсем не было видно.

Ранее уже было установлено, что количество и активность белков UCP в буром жире стимулируется норадреналином (G. Mory et al., 1984. Noradrenaline controls the concentration of the uncoupling protein in brown adipose tissue). Предположив, что таким же образом норадреналин вероятнее всего действует и в тканях мозга, авторы измерили плотность норадренергических синапсов в изучаемых тканях мозга животных. Чтобы пометить и подсчитать такие синапсы, использовали антитела к ферменту (коротко обозначаемому DBH), который превращает дофамин в норадреналин и присутствует в нервных окончаниях клеток, выделяющих норадреналин в качестве нейромедиатора. Как и ожидали авторы, плотность таких синапсов в тканях китообразных оказалась в среднем выше, чем у парнокопытных. Статистически достоверным это различие оказалось только в сером веществе коры головного мозга (рис. 5).

Так кто же из ученых прав: защитники гипотезы эволюции социального интеллекта китов или Пол Мейнджер с его гипотезой о гомеостатической функции как фактора, определившего вектор эволюции большого мозга?

Попробую высказать предположение, что Мейнджер может быть прав одновременно с Лори Марино. Мне кажется логичным и весьма вероятным, что, действительно, первоначальным пусковым фактором для увеличения размера мозга стало именно то, что при большем размере этот орган мог лучше сохранять постоянство температуры. И что оптимизация именно этой функции сохранения температуры действительно стимулировала формирование множества особенностей биохимии, физиологии (в том числе особенностей сна) и анатомии (включая большие размеры) мозга китов. Но вполне укладывается в современное понимание хода эволюции и предположение, что эти же особенности могли, в свою очередь, стать преадаптациями для развития — как ни крути — действительно незаурядных интеллектуальных способностей китообразных (вполне доказанных по крайней мере для некоторых из них).

Подобным же образом перья птиц, которые традиционно рассматриваются с точки зрения их функции для полета, первоначально возникли еще у нелетающих динозавров и, кстати, все с тем же назначением — поддержание температурного гомеостаза. То есть перья стали преадаптацией, сделавшей возможным последующее развитие полета у некоторых потомков оперенных динозавров.

После всего сказанного хочется сделать одну маленькую, но важную ремарку. На сегодняшний день, в сущности, нет данных о том, какую именно функцию выполняют белки UCP в мозге. Эта функция может вовсе не иметь отношения к генерированию тепла, а участвовать, к примеру, в каких-то метаболических процессах (M. J. Gaudry, M. Jastroch, 2019. Molecular evolution of uncoupling proteins and implications for brain function). Так что при всей своей занятности и привлекательности, тезисы авторов пока остаются в значительной мере гипотетическими и требуют дальнейшей работы по сбору доказательств.

Источник: Paul R. Manger, Nina Patzke, Muhammad A. Spocter, Adhil Bhagwandin, Karl Æ. Karlsson, Mads F. Bertelsen, Abdulaziz N. Alagaili, Nigel C. Bennett, Osama B. Mohammed, Suzana Herculano-Houzel, Patrick R. Hof & Kjell Fuxe. Amplification of potential thermogenetic mechanisms in cetacean brains compared to artiodactyl brains // Scientific Reports. 2021. DOI: 10.1038/s41598-021-84762-0.

Татьяна Романовская

2019 Стандартные планы M и специальные чертежи проектов — Министерство транспорта штата Колорадо

Эти листы не пронумерованы, потому что они будут включены в наборы планов автомагистралей и предполагают последовательность нумерации набора. Исходные стандарты M 2019 г. в формате PDF (для файлов меньшего размера — Часть 1, Часть 2) | Обложки книг Дополнения: новые и пересмотренные стандарты M, которые заменили оригиналы в книге 2019 года.
Стандартный номер плана M	Название стандартного плана (и количество листов, если 2 и более) и описание.
Применение стандартных планов	Инструкция по использованию стандартных планов M&S.
Содержание	Стандарты M&S — Содержание
М-100-1	Стандартные символы (3 листа) — символы, типы линий и шаблоны для плановых листов.
М-100-2	Акронимы и сокращения (4 листа) — Акронимы и сокращения, которые могут использоваться на листах планов.
М-203-1	Подъездные дороги — Подъездная дорога и геометрия среднего перекрестка.
М-203-2	Типы канав — Вид сверху, участки с бетонным и травяным покрытием, вырезанные участки и участки насыпи.
М-203-11	Шоссе виража с венцом и разделенными участками (3 листа) — Величина виража и биение.
М-203-12	Улицы виража (2 листа) — Величины виража и диаграммы биения.
М-206-1	Земляные работы и засыпка сооружений (2 листа) — Земляные работы, засыпка, насыпь, подсыпка.
М-206-2	Земляные работы и засыпка мостов (2 листа) — Земляные работы и засыпка конструкций.
М-208-1	Временный контроль эрозии (11 листов) — Типичные области применения для контроля эрозии.
М-210-1	Поддерживает почтовый ящик (2 листа) — Подробная информация для нескольких различных установок, переводы почтовых ящиков.
М-214-1	Детский инвентарь — Детали для посадки деревьев и кустарников.
М-216-1	Удерживающее покрытие для грунта (2 листа) — Маты для укрепления газона (TRM) Наклонное покрытие, используемое на крутых склонах, в неблагоприятных почвах и при повышенных гидравлических нагрузках.
М-412-1	Стыки бетонных покрытий (5 листов) — Установка стыков и дюбелей для бетонных проезжих частей.
М-412-2	Ремонт трещин на бетонном покрытии (4 листа) — Подробная информация о перекрестной вышивке, установке пазов и дюбелей. (Выпущено 7 октября 2019 г.)
М-510-1	Нагрузка для трубы из конструкционной плиты H-20 — Таблицы нагрузки для трубы из конструкционной плиты H-20.
М-601-1	Однобетонный коробчатый водовыпуск (CIP) (2 листа) — Детали и таблицы одинарного бетонного коробчатого водовода.
М-601-2	Двойной бетонный коробчатый водовыпуск (CIP) (2 листа) — Детали и таблицы двойного бетонного коробчатого водопропускного канала.
М-601-3	Тройной бетонный коробчатый водовыпуск (CIP) (2 листа) — Детали и таблицы тройного бетонного коробчатого водопропускного канала.
М-601-10	Перегородка для труб — Таблицы количества перегородок, включая соединение с крыльями.
М-601-11	Седловые перегородки типа «S» для трубы — Таблицы количества перегородок.
М-601-12	Покрытие оголовья и выходное отверстие для труб — Столы оголовья и покрытие выпускного отверстия для труб диаметром 48 дюймов или меньше.
М-601-20	Стены крыла для трубных или коробчатых культиваторов — Таблицы с указанием количества, соединений, перегородки и фартука.
М-603-1	Металлическая труба (4 листа) — Таблицы для металлических труб, включая пределы покрытия и основания.
М-603-2	Железобетонная труба — Таблицы для RCP, включая пределы покрытия и требования к основанию.
М-603-3	Коробчатый водопровод из сборного железобетона — Требования к монтажу сборных бетонных перекрытий, основания и стыков. ( Выпущено 10 сентября 2020 г. )
М-603-4	Гофрированная полиэтиленовая труба (AASHTO M294) и полипропиленовая труба (AASHTO M330) — Монтаж и высота покрытия для гофрированных полиэтиленовых труб.
М-603-5	P Труба из поливинилхлорида (ПВХ) (AASHTO M304) — Монтаж и высота покрытия для труб из поливинилхлорида (ПВХ).
М-603-6	Ребристая труба из полиэтилена, армированного сталью (AASHTO MP 20) — Детали для установки ребристой трубы из полиэтилена, армированного сталью (AASHTO MP 20).
М-603-10	Концевые секции из бетона и металла (2 листа) — Таблицы для общих концевых секций труб.
М-603-12	Проходные концевые секции и защитные решетки — Проходные концевые секции и решетки для металлических и бетонных дренажных труб.
М-604-10	Впуск, тип C — Детали впуска для трубы с внутренним диаметром 30 дюймов или меньше.
М-604-11	Впуск, тип D — Детали впуска для трубы с внутренним диаметром 42 дюйма или меньше.
М-604-12	Входной патрубок типа R (2 листа) — Детали входа с таблицами количества и диаграммами изгиба арматуры.
М-604-13	Входное отверстие для бетона, тип 13 — Входное отверстие для желобов.
М-604-20	Люки (3 листа) — Детали люков монолитные, сборные и Т-образные.
М-604-25	Впускной патрубок с лопаточной решеткой (5 листов) — Детали арматурного стержня и таблицы количества для впускных отверстий 36 дюймов и 72 дюймов.
М-605-1	Подземные дрены — Подробная информация о различных приложениях.
Часто задаваемые вопросы (FAQ) о ограждениях CDOT, противоударных подушках и средствах обработки концов
М-606-1	Система ограждений Midwest Guardrail (MGS), W-образная балка, тип 3, 31 дюйм (19 листов) — Размещение, установка, материалы и спецификации.(Выпущено 5 марта 2020 г.)
М-606-13 Используйте этот стандарт только для технического обслуживания и ремонта .	Ограждение типа 7 F-образное ограждение (4 листа) — Детали для бетонного ограждения F-образной формы.
М-606-14	Сборный бетонный барьер типа 7 (4 листа) — Детали арматурного стержня и соединения штифтов и петель. (Выпущено 21 августа 2020 г.)
М-606-15	M-606-15 Ограждение, тип 9, одностороннее ограждение (11 листов) — бетонное ограждение с односкатными сторонами.(Выпущено 5 марта 2020 г.)
М-607-1	Заборы и ворота из проволоки (3 листа) — Забор из колючей или комбинированной проволоки, деревянные или металлические столбы.
М-607-2	Забор звена цепи (3 листа) — Детали забора и ворот с материалами и деталями оборудования.
М-607-3	Barrier Fence — Барьерный забор с деталями из стальных столбов.
М-607-4	Забор, ворота и пандусы для оленей (7 листов) — детали ограждения, ворот и рампы.(Выпущено 13 июля 2020 г.)
М-607-10	Picket Snow Fence — Пикетный снежный забор с деталями из стальных столбов.
М-607-15	Заградительные ворота (9 листов) — Особенности оборудования и размещения ворот на автомагистралях.
М-608-1	Пандусы для бордюров (10 листов) — виды в плане, фасадах и разрезах. Подробная информация об обнаруживаемых предупреждениях.
Дополнительная информация, касающаяся M-608-1, Бордюрные пандусы	CDOT ADA Программные документы и ресурсы
М-609-1	Бордюры, водостоки и тротуары (4 листа) — Детали для компенсаторов и въездов на подъездные пути.
М-611-1	Защитное ограждение для скота (2 листа) — Защитное ограждение для скота с крыльями из стали и дерева.
М-611-2	Deer Guard (2 листа) — Защитный кожух для оленей с деревянными и стальными деталями крыльев.
М-614-1	Rumble Strips (3 листа) — временное и постоянное использование для плеч, полос движения и осевых линий.
М-614-2	Массивы бочек с песком (2 листа) — макеты для расчетных скоростей до 75 миль в час, включая веса.
М-615-1	Устройство для защиты набережных, тип 3 — Обмывание откосов с использованием гибкой трубы и асфальтированного фартука.
М-615-2	Устройство защиты набережной, тип 5 — Обмывание откосов с использованием мощеного покрытия и брусчатки.
М-616-1	Обратный сифон — Бетонная сифонная труба с защитным кожухом, клапанной коробкой и дренажными деталями.
М-620-1	Полевая лаборатория, класс 1 — Полевая лаборатория 8 футов x 26 футов.
М-620-2	Полевая лаборатория, класс 2 (2 листа) — Полевая лаборатория размером 12 x 28 футов.
М-620-11	Полевой офис, класс 1 — Полевой офис 8 футов x 26 футов.
М-620-12	Полевой офис, класс 2 — Полевой офис 12 футов x 50 футов.
М-629-1	Обследование памятников (2 листа) — Таблица применения памятников и детали крышек памятников.
Особенности проекта
Письма об утверждении FHWA
Средства проектирования
Форма CDOT 1300 — Подача нового или пересмотренного стандартного плана или специальной детали проекта.
Если вы являетесь сотрудником, консультантом или подрядчиком CDOT и хотите получать электронные письма с последними изменениями стандартов M&S, пожалуйста, напишите нам по электронной почте . Включите свое имя, название компании и адрес электронной почты, на который вы хотите получать эту информацию.

Роль водорода и топливных элементов в мировой энергетической системе

Водородные технологии пережили циклы завышенных ожиданий, за которыми следовало разочарование.Тем не менее, все больше данных свидетельствует о том, что эти технологии представляют собой привлекательный вариант для глубокой декарбонизации глобальных энергетических систем, и что недавние улучшения в их стоимости и производительности также указывают на экономическую жизнеспособность. Этот документ представляет собой всесторонний обзор потенциальной роли, которую водород может играть в обеспечении электроэнергией, теплом, промышленности, транспорта и хранения энергии в низкоуглеродной энергетической системе, а также оценку статуса водорода в том, что касается его способности выполнять эту задачу. потенциал.Возникающая картина является весьма многообещающей: водород хорошо зарекомендовал себя в определенных нишах, таких как вилочные погрузчики, а сейчас появляются и основные области применения. Транспортные средства, работающие на водороде, коммерчески доступны в нескольких странах, и было продано 225 000 систем домашнего отопления на топливных элементах. Это шаг вперед по сравнению с ситуацией пятилетней давности. Этот обзор показывает, что проблемы, связанные со стоимостью и производительностью, остаются, и для того, чтобы водород стал действительно конкурентоспособным, по-прежнему требуются значительные улучшения.Но такая конкурентоспособность в среднесрочной перспективе больше не кажется нереалистичной перспективой, что полностью оправдывает растущий интерес и политическую поддержку этих технологий во всем мире.

Эта статья в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Онколитический вирус убивает опухолевые клетки и поддерживает иммунные клетки

15 октября 2019 г. , от NCI Staff

Клетка, инфицированная вирусом осповакцины.Некоторые из изучаемых онколитических вирусов представляют собой сконструированные вирусы осповакцины.

Кредит: J Cell Biol. Апрель 2005 г. CC BY 4.0

Вирусы, созданные для уничтожения раковых клеток, уже используются для лечения одной формы рака кожи и широко тестируются в качестве средств лечения других видов рака.

Новое исследование предполагает, что такие вирусы, известные как онколитические вирусы, могут быть дополнительно усилены для улучшения иммунного ответа организма против опухолей.Исследователи обнаружили, что этот новый тип онколитического вируса может одновременно убивать раковые клетки и обеспечивать иммунные клетки, втянутые в опухоли, гормоном, необходимым им для выполнения своих собственных функций уничтожения клеток.

У мышей с опухолями меланомы вирус двойной функции был гораздо более эффективным в уменьшении размера и уничтожении опухолей, чем стандартный онколитический вирус.

Результаты исследования были опубликованы 17 сентября в номере Immunity .

«Новым здесь является то, что этот вирус был разработан для снятия иммуносупрессии» в дополнение к прямому уничтожению опухолевых клеток, — объяснил Филип Дашнер, программный директор отдела биологии рака NCI, который не принимал участия в исследовании.«Это идея, которую можно быстро перенести на пациентов».

Выключение из-за токсичной среды

Онколитические вирусы убивают отдельные раковые клетки, но исследования также показывают, что они могут повысить способность иммунной системы распознавать и уничтожать опухоль.

Вирусы специфически проникают в опухолевые клетки и размножаются, в конечном итоге разрушая клетки. Когда происходит этот разрыв, белки опухолевых клеток, которые могут распознаваться иммунной системой, называемые опухолевыми антигенами, попадают в кровоток.Этот процесс может втягивать Т-клетки в опухоль, чтобы начать убивать раковые клетки, и потенциально может даже заставить их распознать метастатический рак в другом месте тела.

Но заставить Т-клетки достичь опухоли и проникнуть в нее — это только часть проблемы, — объяснил Грег Делгофф, доктор философии из Медицинского центра Университета Питтсбурга, который руководил новым исследованием. «Среда опухоли по своей природе токсична», — сказал он. «Когда Т-клетки попадают внутрь, они оказываются в суровом пустынном ландшафте с низким содержанием кислорода.«Эта среда может лишить иммунные клетки возможности функционировать.

Лаборатория доктора Делгоффе тестировала онколитический вирус (модифицированная версия вируса осповакцины ), чтобы лучше понять, как взаимодействие между раком и иммунными клетками изменяется после вирусного заражения опухоли. Они обнаружили, что при введении в опухоли мышам их вирус был способен индуцировать попадание в опухоли значительного количества Т-клеток.

Исследователи обнаружили, что недавно прибывшие Т-клетки оказались здоровыми и энергичными.Но способность Т-клеток убивать может исчезнуть, превратив их из мощных разрушителей в истощенных сторонних наблюдателей с ограниченной способностью повредить раковые клетки — явление, часто называемое истощением.

Т-клетки, которые доктор Дельгоффе и его команда первоначально обнаружили в опухолях, не были исчерпаны, что позволяет предположить, что они недавно попали в опухоли. Однако дополнительные тесты показали, что у этих вновь прибывших Т-клеток быстро развились метаболические проблемы после попадания в опухоль.

Люди часто называют иммунотерапию «ускорителями» или агентами, которые «снимают тормоза» с иммунной системы.- сказал Дельгольф. «Но ускорители и тормоза не имеют значения, если в баке нет бензина».

«Вирус сам по себе действительно хорошо справлялся с активацией иммунных клеток», — сказал он. Поэтому исследовательская группа хотела улучшить вирус, продолжил он, чтобы он выделял что-то в окружающей среде, чтобы обеспечить газом Т-лимфоциты.

Поддерживающие Т-клетки

Команда быстро определила гормон лептин в качестве возможной поддерживающей молекулы.Лептин известен тем, что помогает телу регулировать чувство голода и, следовательно, вес. Но он также необходим иммунным клеткам организма.

Не только опухоли, которые исследователи проанализировали, имели низкие концентрации лептина, но и Т-клетки в этих опухолях имели высокий уровень рецептора гормона. «Это особенно верно для истощенных Т-лимфоцитов», — пояснил доктор Дельгольф.

Исследования клеточных культур показали, что высокие уровни лептина увеличивают способность Т-клеток убивать опухолевые клетки.Поэтому исследователи попытались ввести высокие дозы лептина непосредственно в кровоток мышей с опухолями меланомы. Однако доставленный таким образом лептин не влиял на Т-клетки в опухолях.

Чтобы заставить лептин проникнуть глубоко в микросреду опухоли, команда доктора Дельгоффе модернизировала свой онколитический вирус, чтобы он несли ген для производства лептина. Попав внутрь раковой клетки, вирус также будет производить лептин, когда копирует себя.

Когда исследователи вводили свой двойной функциональный вирус непосредственно в опухоли меланомы у мышей, опухоли значительно уменьшились, и примерно у четверти мышей был полный ответ (то есть их опухоли полностью исчезли).Эти мыши жили значительно дольше, чем мыши, которым вводили контрольный вирус, не несущий гена лептина.

Вирус, экспрессирующий лептин, также улучшил выживаемость на мышиной модели агрессивного рака поджелудочной железы.

Напротив, лептин-экспрессирующий вирус не увеличивал выживаемость у мышей с опухолями, которые, как уже известно, имеют микроокружение, поддерживающее Т-клетки, сверх того, что наблюдалось при инъекции онколитического вируса, который не включал ген лептина.

Возможности предотвращения рецидива рака

Инъекция лептин-экспрессирующего вируса, по-видимому, также служила противораковой вакциной у некоторых мышей с меланомой.Когда команда ввела те же опухолевые клетки мышам, которые испытали полный ответ на созданный лептином вирус, иммунная система большинства этих мышей предотвратила повторный рост опухоли.

У меньшинства мышей, у которых опухоль снова росла, опухоли росли медленнее. Это говорит о том, что созданный вирус заставил иммунную систему запоминать и распознавать опухолевые клетки (иммунная память), — сказал доктор Делгоффе.

«Очень интересно, что есть некоторые доказательства иммунной памяти против опухолей», — сказал Дашнер.«Если бы это могло работать так, как работает вакцина, мы надеемся, что у пациентов разовьется иммунитет, который мог бы предотвратить рецидив опухоли».

Доктор Делгофф и его команда сейчас исследуют, может ли изменение лептинового компонента вируса привести к лучшим ответам. Эти хитрости включают разработку лептина, чтобы улучшить его обнаружение и связывание с Т-клетками, а также продлить его срок службы в микросреде опухоли. Исследователи также планируют проверить добавление к своему вирусу других поддерживающих молекул, помимо лептина.

Необходимы дальнейшие исследования, прежде чем вирус двойного действия будет готов для тестирования на людях, включая понимание того, может ли вирус работать так же хорошо, как при введении в кровоток, так и при введении в опухоль, пояснил Дашнер. По его словам, прямая инъекция в опухоль не всегда возможна для людей.

Вирусы — не единственный микроб, изучаемый в качестве потенциальных средств лечения рака. Инициатива NCI Bugs as Drugs, например, поддерживает исследования в области лечения, основанного на бактериях и бактериофагах (крошечные вирусы, заражающие бактерии).«Это очень интересный класс потенциальных новых методов лечения», — сказал он.

Сюрприз и чудо ранней анимации

Анимационные фильмы стали большим бизнесом с тех пор, как фильм Уолта Диснея 1937 года «Белоснежка и семь гномов» стал самым прибыльным в том году. С развитием цифровой анимации в этом веке финансовое влияние СМИ стало еще больше. За последнее десятилетие по меньшей мере девять анимационных фильмов (во главе с гиперреалистичной версией «Короля льва» этого года) собрали более миллиарда долларов каждый в мировом прокате.Цифровые эффекты дают аниматорам огромные возможности для создания экстравагантных фантазий; все кажется возможным. Тем не менее, когда на кону так много денег, бесконечные возможности среды часто используются для узкого круга проверенных рынком формул.

Чтобы заново открыть для себя спонтанность, свободное воображение и необузданное чувство веселья, лежащие в основе медиума, вернитесь к его истокам. Перескочите через век компьютерных изображений и даже золотой век рисованных мультфильмов с участием Багза Банни, Бетти Буп и Микки Мауса и погрузитесь в шедевры первых лет анимации.В эпоху немого кино смелые индивидуалисты проверяли крайности техник, которые они, возможно, также изобрели. Многие из этих немых мультфильмов — больше, чем просто исторические диковинки — это головокружительные развлечения, которые стоят рядом с такими классическими немыми комедиями с живыми боевиками, как комедии Мака Сеннета, Чарли Чаплина и Бастера Китона. Более того, многие из этих фильмов — которые находятся в общественном достоянии, их авторские права давно истекли — скрываются на виду, бесплатно, на YouTube и других сайтах (и их легко найти по их режиссерам и названиям).

И все же мобильный телефон или портативный компьютер только намекают на шок, который вызывает «Фантасмагория» Эмиля Коля, ¹ 1908 года, один из первых рисованных анимационных фильмов, представленных на большом экране. Он открывается крупным планом, на котором рука художника прыгает на черный экран и быстро рисует — видение артистизма, возвещающее о силе средства массовой информации. Далее мы видим клоуна, свисающего с перекладины, а затем в течение двух минут царит изысканно управляемый хаос. Прорастающее растение поднимает голову клоуна и передает ее другому мужчине, пока клоун без головы занимается гимнастикой.Бутылка шампанского становится цветком, который становится хоботом слона. Галлюцинаторное изменение формы Коля было громом, показывая, что анимацию можно использовать не только как любопытство. Он вдохновил других карикатуристов и художников комиксов последовать за ним в мир анимации. Вместе они создали кинотеатр открытий, удивлений и чудес.

Подобно тому, как живые боевики превзошли свои корни в фотографии и театре, анимационные фильмы — заимствованные из комиксов, волшебных шоу и водевилей — взлетели и стали своеобразным и таинственным видом эстетического опыта.Но их создатели быстро обнаружили конкретное препятствие на пути этого эстетического расцвета: насколько сложно снимать фильмы. Ранние игровые короткометражки, такие как «Сеннетт» и «Чаплин», можно было снимать быстро, даже за один день, со случайными или несуществующими сценариями. С другой стороны, каждая минута анимационного фильма требовала по крайней мере девятисот шестидесяти четко прописанных рисунков. А готовые фильмы, несмотря на их трудоемкость, выглядели просто: штриховые рисунки на резервном фоне.

Ранние аниматоры решили эту проблему, выбрав отображение самого требовательного процесса. Коул заснял свою руку, когда рисовал «Фантасмагори». Иллюстратор Уинзор Маккей пошел еще дальше со своим первым фильмом «Маленький Немо», ² , который был продолжением его знаменитого комикса «Маленький Немо в стране сна». Фильм в основном представляет собой живое действие, фальшивый документальный фильм, в котором Маккей встречает друзей и принимает джентльменский вызов ³ , чтобы в течение месяца сделать четыре тысячи рисунков и привести их в действие.Он потеет под давлением, переживая несколько неудач. ⁴ Ближе к концу фильма он включает проектор, и на экране появляется рисунок под рубрикой « СМОТРИ МЕНЯ ДВИЖУСЬ, ». ⁵ Анимация рудиментарная, но выразительная: знаменитые персонажи Маккея, некоторые из которых представляют собой расистские карикатуры, начинают бегать и танцевать, растягиваться и сжиматься, словно в кривых зеркалах, демонстрируя как реалистичность анимации, так и ее легкий переход в фантазию. .

Третий фильм Маккея, «Герти-динозавр», ⁶ представил того, что стало любимым персонажем, вероятно, первым, кто родился в анимационном фильме.Герти, неуклюжий и дружелюбный зверь, выходит из пещеры. ⁷ Маккей деликатно изображает ее, изо всех сил стараясь, чтобы мелкие морщинки ее тела волновались вместе с ее дыханием. ⁸ Аниматор «разговаривает» с Герти на карточках с титулами и, как цирковой дрессировщик, приказывает ей поднимать одну ногу, а затем другую — и даже рисует себя крошечным персонажем, входящим с ней в доисторический пейзаж. Самый вдохновляющий момент фильма проистекает из его самого жесткого ограничения: скудно детализированного фона.Когда Герти хватает шерстистого мамонта ⁹ за хвост и бросает его в озеро, Маккей использует это пустое пространство и уменьшает мамонта до крошечных размеров, когда он комично исчезает вдалеке.

Первое поколение аниматоров часто создавало вымышленные взаимодействия с нарисованными от руки персонажами. Никто не сделал это смелее, чем братья Макс и Дэйв Флейшеры — наиболее известные в эпоху звука создатели сериалов «Попай» и «Бетти Буп» — которые были в восторге от головокружительной комедии с анимированными персонажами, которые меняют столы. создатели.Их безмолвные шорты «Из чернильницы» — это бредовые метафизики, показывающие, как Макс работает в своем офисе, рисует маленького клоуна, который находит способы убежать от листа бумаги и причинить вред окружающему миру. В «Дразнящей мухе», ¹⁰ клоун одалживает перьевую ручку Макса, чтобы сбить муху, размахивает пером и разбрызгивает чернила со страницы — на лицо Макса. ¹¹ «Пузыри» ¹² показывает Макса и клоуна, соревнующихся, чтобы надуть самый большой мыльный пузырь. Клоун бросает вызов своему создателю, создавая пузырь, в котором он плывет со страницы, ¹³ из окна, на улицу и в радиатор чужой машины.В «Прыгающих бобах» ¹⁴ клоун делает штамп по своему собственному подобию, клонируя себя и захватывая офис ¹⁵ с армией клоунов, которые лассонируют Макса и сбивают его с ног.

Ранний дух экспериментов в анимации длился недолго. В 1914 году продюсер Дж. Р. Брей и аниматор Эрл Херд начали патентовать процесс, известный как целая анимация, что стало решающим шагом в индустриализации этого вида искусства. Брей также создал студию для быстрого создания мультфильмов для широкого распространения.«Как создаются мультфильмы», фильм ¹⁶ от 1919 года, режиссер Уоллес Карлсон, демонстрирует, как эта коммерциализация ограничивала свободу аниматора. Карлсон появляется на экране и объясняет (в титульной карточке): «Первое, что нужно сделать, это получить ОК. по сценарию »; ¹⁷ затем он стучит в дверь с надписью « J. R. Bray ». Позже нам показывают титульную карточку, на которой написано: «После того, как пленка проявлена ​​и напечатана, мультфильм будет спроектирован для критики». ¹⁸ Брей появляется на экране и приказывает Карлсону изменить одну сцену.

Карлсон завершает самоуничижительную комедию с едва скрываемым раздражением: на титульном листе написано: «Как только мы исправим эту« пробежку »и сделаем остальные шестьдесят две сцены, мы будем рады, если вы увидите картину. ” ¹⁹ Печаль, которая окрашивает этот кляп, подчеркивается очарованием и воодушевлением, представленным в мультфильме «Он решает не курить», ²⁰ , который Карлсон сделал четырьмя годами ранее для студии Essanay, где также работал Чаплин. в то время.

Это сладкий анекдот про уличного парня по имени Дад и его собаку, приправленный жаргонной драчливостью. Собака выполняет трюки ²¹ , изображенные с озорной радостью, — ходит на передних лапах и стоит на голове. Усатый отец Дуда сидит в кресле, наслаждаясь своим одиночеством с такой же жестикуляцией: он затягивает трубку, подбрасывает туфлю ²² в воздух и снова на ногу, выпускает кольца дыма и вдыхает их, а затем засыпает.Заглянув в окно, Дад решает украсть трубку. Когда ему хочется закурить, комедия смешивает домотканую мораль с космическими скачками фантазии. Клубы дыма образуют видения, ²³ одновременно соблазнительные и угрожающие, пока дьявольский «дух дыма» не клянется преподать Дуду урок и не поднимает его с земли через облака на луну, ²⁴ в то время как собака плачет и буквально заливает слезами улицу.

Пожалуй, самой разоблачающей карьерой в ранней анимации стала карьера Грегори Ла Кава, который начинал как рисовальщик газет и — до того, как перешел на живые боевики, — снял десятки короткометражных мультфильмов.Один из них предвещает грандиозные достижения Ла Кава как режиссера художественных фильмов. (Его самые известные работы — сумасшедшая комедия «Мой мужчина Годфри» и комедийная драма «Дверь на сцену».) Название этого мультфильма «Дыхание нации» ²⁵ подмигивает гротескно-расистскому произведению Д. У. Гриффита. драма, но на самом деле это комедия о сухом законе, выпущенная в 1919 году.

В «Дыхании» Ла Кава разворачивает круговорот хитроумных поворотов и трюков. Фильм является частью серии мультфильмов с участием круглоголового судьи Рамми и его друга Шелковая шляпа Гарри.Предпосылка берет стереотип мужа-подкаблучника, но сказка ясно дает понять, что судья нуждается в серьезном клевании. Когда властная жена Рамми тащит его на собрание по воздержанию, где он будет «ужасным примером» ²⁶ , он пробирается к фонтанчику с газировкой Гарри, который является фасадом для бара. Хотя комедия так же легко подходит для живого действия, анимация Ла Кавы преображает основные ситуации фильма с восхитительной невозможностью, например, когда толпа смешных посетителей ²⁷ внезапно материализуется позади, рядом и под широкоплечим посетителем бара; сварливый пьяница завязывает узлом фонарный столб, ²⁸ отправляя перепуганного Рамми горизонтально вверх по стене; и Гарри под испепеляющим взглядом жены Рамми съеживается в шляпе.Персонажи и шутки в этом фильме задают шаблон для будущих поколений комедийных мультфильмов.

Большая часть ранней анимации была потеряна, например, новаторские фильмы Хелены Смит Дейтон. Но сохранившаяся анимация немой эпохи предлагает широкий спектр удовольствий, в том числе глиняную анимацию, которая демонстрируется в «Зеленых пастбищах» китайско-американского художника Джозефа Санна, ²⁹ и которую Уоллес Маккатчен объединил с живым действием в «Скульпторе». Ночной кошмар»; ³⁰ лирическая покадровая анимация с куклами в «Мэри и Гретель», ³¹ Говарда С.Мох; геометрические абстракции из «Опуса 1» Вальтера Руттмана; ³² и замысловатые интерактивные силуэты в «Золушке» Лотте Райнигер ³³ и шумно-античные из «Следуй за ласточкой» Брайанта Фрайера. ³⁴ Они тоже, как и многие другие в этом жанре, находятся в свободном доступе в Интернете, ожидая, чтобы вдохновить заново. Они стоят как забытый канон расширенного воображения из времен, подобных нынешнему в анимации, когда все кажется возможным. ♦

Новый набор инструментов для автоматического обнаружения ядер в интактных тканях и плотных 3D-культурах

Образец цитирования: Blin G, Sadurska D, Portero Migueles R, Chen N, Watson JA, Lowell S (2019) Nessys: A new набор инструментов для автоматического обнаружения ядер в интактных тканях и плотных 3D-культурах.ПЛоС Биол 17 (8): e3000388. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388

Академический редактор: Кейт Г. Стори, Университет Данди, ВЕЛИКОБРИТАНИЯ

Поступила: 17 января 2019 г .; Дата принятия: 2 июля 2019 г .; Опубликовано: 9 августа 2019 г.

Авторские права: © 2019 Blin et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Наш набор данных изображений DISCEPTS был депонирован в Ресурсе данных изображений https://idr.openmicroscopy.org (Williams et al., 2017) под номером доступа idr0062. Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, используемые для графических диаграмм, общедоступны на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys).

Финансирование: Эта работа финансировалась старшей стипендией Wellcome Trust для SL (WT103789AIA) и стипендией Wellcome Trust сэра Генри Веллкома для Великобритании (WT100133).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: ВСУ, г. произвольные единицы флуоресценции; AP, передне-задний; ДИК, дифференциальный интерференционный контраст; E, эмбриональный день; EMD, Emerin; ER, эндоплазматическая сеть; ES, зародышевый стебель; FACS, сортировка клеток, активируемая флуоресценцией; FP, флуоресцентный белок; GFP, зеленый флуоресцентный белок; GT, наземная правда; ICM, внутренняя клеточная масса; JI, Индекс Жаккара; Mpx, мегапиксели; NE, ядерная оболочка; Нессис, Система сегментации ядерной оболочки; NLS, сигнал ядерной локализации; Sox1, Фактор транскрипции SRY-box 1; Tcf15, фактор транскрипции 15; TE, trophectoderm

Введение

Изучение свойств отдельных клеток по отношению к их соседям в интактных тканях — первый шаг к пониманию межклеточных взаимодействий, которые управляют поведением тканей.Анализ отдельных клеток также может выявить неоднородность свойств клеток, которая маскируется методами усреднения популяции с более низким разрешением. Автоматизированный вычислительный анализ изображений — особенно привлекательный подход, поскольку он свободен от предвзятости оператора, предоставляет количественные данные и выявляет субвизуальную информацию, которая в противном случае не была бы очевидна [1–4].

Чтобы удовлетворить потребность в автоматизированной ядерной сегментации в 3D, был разработан широкий спектр методов, обзор которых приведен в [2,5–7].Однако становится все более очевидным, что не существует единого универсального решения для сегментации. Новые решения необходимы для ситуаций, в которых ядра плотно упакованы, несферичны или неоднородны по форме, размеру или текстуре: эти вещи применимы ко многим типам эмбриональных и взрослых тканей, а также к клеткам, дифференцирующимся в культуре. Также необходимо сократить время и вычислительную мощность, необходимые для сегментации каждой клетки: это становится ограничивающим фактором при визуализации целых эмбрионов или крупных тканей, при анализе данных покадровой съемки или в любой другой ситуации, когда большое количество ядер необходимо идентифицировать.Наконец, принятие опубликованных методов сообществом может быть ограничено, что подчеркивает важность создания хорошо документированного и удобного для пользователя программного обеспечения [4,8,9].

Здесь мы сообщаем о новом подходе к преодолению этих узких мест в количественном анализе изображений отдельных клеток в 3D. Вместо того, чтобы полагаться на окрашивание для определения ядерного содержимого (например, окрашивание DAPI или Hoescht), мы вместо этого обнаруживаем ядерную оболочку (NE). Это упрощает идентификацию отдельных ядер, которые находятся в тесном контакте друг с другом, и не страдает проблемами сегментации, связанными с текстурированным окрашиванием ядер, ядрами необычной формы или клеточными остатками.Кроме того, NE отдельных ядер легко различимы на глаз в переполненных тканях, поэтому ручная коррекция любых неправильно сегментированных ядер становится проще, чем в случае ядер, окрашенных DAPI. Мы предоставляем удобный инструмент редактирования 3D – 4D для быстрого исправления любых ошибок сегментации.

Мы тестируем наш метод вместе с другими ранее опубликованными удобными для пользователя методами, уделяя особое внимание эмбрионам в середине беременности, трехмерным культурам плюрипотентных стволовых клеток и нервным розеткам, полученным из плюрипотентных стволовых клеток.Эти контексты выбраны потому, что они иллюстрируют многие проблемы трехмерной сегментации, которые мы намеревались решить: переполненные перекрывающиеся ядерные сигналы, несферические ядра, большое количество ядер и уменьшение интенсивности сигнала к центру больших структур. Используя наш инструмент редактирования, мы вручную аннотировали тысячи ядер в этих контекстах для создания набора сегментированных изображений, которые становятся общедоступными и могут быть полезны в качестве стандартного набора данных для тестирования сегментации [10].

Мы постоянно получаем точные коэффициенты сегментации> 90% в этих сложных условиях. Мы демонстрируем полезность этого инструмента, измеряя экспрессию фактора транскрипции 15 (Tcf15) при одноклеточном разрешении по передне-задней (AP) оси эмбрионального эмбриона мыши на 8,75-й день (E). Мы также разработали неразрушающий метод флуоресцентной метки NE в живых клетках и использовали его для отслеживания истории межклеточных взаимодействий и для документирования обмена соседями по мере того, как плюрипотентные клетки дифференцируются в 3D-культуре.

Этот новый инструмент, названный «Система сегментации ядерной оболочки (Nessys)», дополняет расширяющийся инструментарий подходов к сегментации, каждый из которых имеет свои сильные стороны. Nessys особенно хорошо подходит для сегментирования большого количества ядер, скомпонованных в сложной трехмерной конфигурации, без необходимости большого количества времени, вычислительной мощности или ввода данных пользователем. Мы предлагаем Nessys как программное обеспечение с открытым доступом, хорошо документированное, простое в установке и удобное для пользователя.

Результаты

Сегментация ядер в группы плотно упакованных клеток

Ядра обычно обнаруживаются на основе флуоресцентных маркеров ядерного содержимого, например, DAPI.Однако может стать трудно различить отдельные клетки на основе окрашивания DAPI, когда ядра плотно переполнены, например, во время нейронной дифференцировки плюрипотентных клеток (рис. 1A слева) или трехмерных культур (рис. 1A справа) или в плотно упакованных тканях in vivo ( Рис 1B).

Рис. 1. Проблемы сегментации и результаты Nessys.

(A) Параллельное сравнение сигналов DAPI и LaminB1, полученных с помощью конфокальной микроскопии плюрипотентных стволовых клеток, дифференцированных в нервные клетки (слева) или выращенных в трехмерной матрице (справа).Стрелки «B» указывают границы между соприкасающимися ядрами, стрелки «D» указывают на клеточные остатки, стрелка «M» показывает митотическое ядро, а стрелки «I» указывают на инвагинации LaminB1 в ядро. (B) Конфокальные микрофотографии, показывающие разнообразие форм и объемов клеток, обнаруженных в эмбрионе мыши E8.75 (слева) и в «монослое» культивируемых клеток (справа). DAPI показан оранжевым цветом, а LaminB1 — голубым. Для каждого изображения увеличенная область показана в виде серии плоскостей вдоль оси z изображения как для канала DAPI, так и для канала LaminB1.Также показано изображение, построенное по осям yz . Слабая вертикальная полоса в плоскостях xy указывает местоположение изображения yz . Белые стрелки: потеря края ядер в сигнале DAPI, красная стрелка: обломки клеток, видимые в сигнале DAPI, белые звездочки: плоские и большие ядра, отличные от окружающих их клеток. (C) Изображения сегментированных ядер, полученные с помощью Nessys. Ядрам присваивается уникальная метка и случайный цвет. Показаны те же области, что и на (B).Обратите внимание, как точно идентифицируются перекрывающиеся ядра с отличной морфологией. E — эмбриональный день; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g001

Мы решили избежать этой проблемы, используя сетевой элемент в качестве ориентира для сегментации. Окрашивание на LaminB1, промежуточную филамент, которая маркирует NE [11], позволяет четко различать переполненные ядра невооруженным глазом (Рис. 1). Это наблюдение побудило нас изучить, будет ли использование сигнала NE в качестве входа для автоматического метода обнаружения успешным подходом.

Это привело нас к разработке метода под названием Nessys, который способен надежно обнаруживать отдельные ядра в переполненных группах (Рис. 1C, S1 Movie). В следующем разделе мы даем обзор этого метода и демонстрируем его полезность.

Обзор метода сегментации Nessys

Здесь кратко описаны основные этапы метода сегментации Nessys (рис. 2). Подробное описание сложных процедур (звездочки на рис. 2) также доступно в текстовом разделе A S1.

• Сигнал NE сначала подвергается гребенчатому детектору (управляемому фильтру), разработанному [12]. Этот фильтр усиливает и сглаживает области гребня. Это улучшает этап прорисовки гребней, облегчая точное отслеживание контура ядер.
• Области максимальной интенсивности флуоресценции затем идентифицируются с помощью детектора различия гаусса [13]. Они образуют отправные точки для процесса динамического отслеживания гребней, который непрерывно идентифицирует и перемещается к самому яркому соседнему пикселю в итеративном процессе (см. Также S1 Fig и S2 Movie).
• Со временем этот алгоритм отслеживания идентифицирует точки ветвления и итеративно устанавливает наиболее вероятное решение сегментации с использованием наивного байесовского классификатора, обученного пользователем (рис. S1 и S2, текст S1, раздел A2).
• После завершения этого процесса для каждого среза z двухмерные области объединяются в трехмерные объемы. На этом этапе информация из соседних срезов помогает уточнить исходные результаты 2D-сегментации (S3 рис, S1 текст, раздел A3).

Рис 2.Обзор метода сегментации Nessys.

Основные шаги метода показаны в белых полях, помеченных синей звездочкой, всякий раз, когда шаг более подробно описывается в тексте S1. Где возможно, показан снимок промежуточного вывода. Итерации представлены оранжевыми прямоугольниками, помеченными значком, указывающим, являются ли итерации параллельными или последовательными. Инструкции, входящие в одну и ту же итерацию, содержатся в одной рамке с закругленными углами. На этапе «древовидная структура гребня» полное дерево накладывается на изображение и соответствует диаграмме слева от изображения.Красный кружок представляет корень (максимум, где была инициализирована процедура), меньшие кружки указывают на листья дерева, а линии представляют ветви дерева. Использование (многоразового) обученного наивного байесовского классификатора показано красным прямоугольником. Этот классификатор обучается пользователем перед запуском метода. DoG, Разница по Гауссу; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g002

В этом методе 2 наиболее требовательных к компьютеру задачи — это процедура отслеживания гребней и дополнительная процедура уточнения объема (S3F рис.).Чтобы сократить время вычислений, 2D-срезы и 3D-объемы обрабатываются параллельно для каждой процедуры соответственно.

Утилита с открытым доступом и набор данных для сравнительного анализа методов ядерной сегментации

Для определения эффективности метода сегментации требуется золотой стандарт (или базовый [GT]) набор данных изображений [10,14–16]. Наборы данных GT могут быть сгенерированы компьютером [17–19] или могут состоять из изображений, сегментированных вручную специалистами-биологами [15].Недавние инициативы были предприняты, чтобы сделать такие наборы данных общедоступными [10]. Однако доступные в настоящее время наборы данных GT для ядерной сегментации содержат только сигнал «ядерного содержания» и, в большинстве случаев, не охватывают разнообразие ядерных форм и размеров или уровень сложности, обнаруживаемый в системах млекопитающих.

По этим причинам мы создали новый набор данных изображений с тысячами вручную аннотированных ядер для тестирования сегментации. Мы использовали как сигнал NE (LaminB1), так и более традиционный сигнал хроматина (DAPI) (рис. 3 и таблица S1).Изображения включают:

• Монослойная культура высокой плотности дифференцирующихся эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши
• 3D-культуры дифференцирующихся ES-клеток мыши, встроенные в Matrigel
• Бластоцисты мыши E3.5
• Гаструлирующий эмбрион мыши на E7.5, фокусируясь на области дистального эпибласта
• Эмбрион мыши после гаструляции на ст. E8.75, фокусирующийся на 3 областях эмбриона, которые захватывают как эпителиальные, так и мезенхимальные структуры, а также вариации в интенсивности сигнала из-за рассеяния света или проблем с проникновением антител

Рис 3.Обзор сегментированного вручную набора данных изображений и примеров карт ошибок, созданных с помощью инструментов проверки и тестирования Nessys.

Репрезентативные тестовые изображения набора изображений DISCEPTS показаны в левом столбце таблицы (масштабные полосы: 50 мкм). Для каждого изображения красные контуры представляют вручную сегментированные области изображения, используемые для оценки точных совпадений и ошибок, которые показаны в виде трехмерных карт в других столбцах. Если нарисовано несколько регионов, число в сером поле указывает соответствие между данным регионом и соответствующей трехмерной картой.Второй столбец: точные ядра, идентифицированные с помощью Nessys. Третий столбец: Карты ошибок Nessys. Четвертый и пятый столбцы: Карта ошибок для лучшей и второй лучшей NN. методы. Легенда этих ошибок указана в правом верхнем углу рисунка. Слияние: только одно ядро ​​обнаружено в AM, когда несколько ядер присутствуют в GT. Мисс: Ядро обнаружено в GT, но отсутствует в AM. Разделение: несколько ядер, обнаруженных в AM, когда только одно присутствует в GT. Шпора: Ядро, генерируемое AM, которого нет в GT. Обратите внимание, что «Monolayer» и «E8.75 ’- это те же изображения, что и на рис. 1В. АМ, автоматизированный метод; E — эмбриональный день; GT, наземная правда; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки; NN., Не Nessys; Шпора, Ложная.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g003

Мы назвали этот набор данных DISCEPTS («Дифференциация стволовых клеток и эмбрионов — боль для сегмента»), поскольку изображения содержат скученные, перекрывающиеся, гетерогенные, несферические ядра. в нескольких различных контекстах, представляющих особые проблемы сегментации, которые мы поставили перед собой.DISCEPTS были депонированы в Image Data Resource [20] под регистрационным номером idr0062 (https://idr.openmicroscopy.org). Чтобы обеспечить независимую проверку наших результатов, мы также предоставляем все переменные Nessys, используемые для сегментации набора данных DISCEPTS в таблице S2, и обучающие наборы для классификаторов в качестве дополнительных данных (данные S1).

Для выполнения ручного аннотирования ядер в 3D и тестирования сегментации, мы разработали дополнительные программы, которые мы предоставляем вместе с методом Nessys (S4 Рис.):

• Инструмент 3D-рисования для определения данных сегментации GT (по нашим оценкам, примерно 100 3D-ядер были сегментированы вручную в час).Обратите внимание, что этот инструмент также можно использовать в качестве визуального инспектора и 3D-редактора для контроля результатов любых автоматизированных методов.
• Расширяемый компаратор сегментации, который может вычислять показатели бенчмаркинга, описанные в [15], а также трехмерные карты точных совпадений и ошибок сегментации (рис. 3, рис. S4 и таблица S3). Это позволяет визуально сравнивать частоту и распределение каждого класса ошибок сегментации для каждого тестируемого результата сегментации.

Используя эти новые инструменты и наш набор данных DISCEPTS, мы сравнили производительность Nessys с другими ранее опубликованными популярными методами, перечисленными ниже:

• MINS [21]: изначально разработан для обнаружения клеток в доимплантационных эмбрионах на основе содержания ядер
• Farsight [22]: предназначен для обнаружения ядер на основе ядерного содержимого
• Ilastik [23]: более универсальный метод, использующий машинное обучение (чтобы использовать все возможности Ilastik и добиться максимальной производительности, мы использовали каналы NE и DAPI в качестве входных данных для информирования метода Ilastik; см. Также Материалы и методы) .

Таблица трехмерных карт ошибок, показанная на рис. 3, намекает на тот факт, что Nessys действительно хорошо работает в областях, где ядра плотно упакованы или где клетки плоские и перекрываются (монослой и ацинусы). Мы действительно заметили немного более высокую долю пропущенных ядер у эмбрионов по сравнению с методами, отличными от Nessys. Изучая отдельные изображения, мы смогли подтвердить, что эта проблема в основном может быть связана с потерей сигнала NE при митозе клеток. В целом, этот предварительный анализ показал, что Nessys работает сравнимо с другими инструментами для относительно простых задач (например,g., бластоцисты) и могут иметь преимущество в более сложных условиях.

Количественная оценка показателей производительности Nessys в сравнении с другими методами с использованием набора данных DISCEPTS

Для дальнейшей оценки эффективности тестируемых методов в наборе данных DISCEPTS мы представили точность и отзывчивость для каждого метода и биологического образца в виде радиолокационного графика (рис. 4A). Точность измеряет пропорцию форм на тестируемом изображении, которые соответствуют реальным формам на изображении GT (сегментированное вручную изображение).Напоминание указывает пропорцию форм в изображении GT, которые присутствуют в тестируемом изображении. Другими словами, точность — это мера того, какая часть обнаруженных форм действительно реальна, а функция вспоминания измеряет, сколько реальных фигур было обнаружено (см. Также текст S1, разделы B 1 и 2). F-мера, сочетающая точность и отзывчивость, приведена в таблице S4.

Рис. 4. Подсчет ошибок, морфологическая точность и сравнительный анализ вычислительного времени.

(A) Радарные диаграммы, показывающие точность и отзывчивость для каждого протестированного метода в наборе данных DISCEPTS.(B) Гистограмма с накоплением, показывающая соотношение точности обнаружения и ошибок для каждого протестированного метода сегментации («M»: монослой, «A»: Acini, «B»: бластоцисты, «7»: E7.5, «8»: E8.75). (C) Гистограммы отклонения морфологических признаков от наземной истины (для создания единого графика для каждого признака, 200 ячеек из каждого набора биологических данных были случайным образом выбраны и объединены вместе, чтобы каждый набор данных вносил равный вклад в график). В таблице приведены средние значения и стандартное отклонение распределения для каждого протестированного метода («N»: Nessys, «I»: Ilastik, «M»: MINS, «F»: Farsight).Вертикальная пунктирная линия показывает значение меры достоверности (см. Также текст S1, раздел B3). (D) Максимальный размер изображения, успешно обработанного протестированными методами, в ГБ. Прочерки показывают, что самое большое протестированное изображение было успешно обработано. (E) Время обработки в секундах, записанное для каждого протестированного метода на эталонных изображениях размером <200 МБ. (F) Технические характеристики компьютера, используемого для тестирования. (G) График разброса количества обработанных Nessys ячеек в секунду в зависимости от размера входного изображения (E8.75 зона 1, размер которой изменен путем изменения либо размера плоскости, либо количества плоскостей при неизменном разрешении). Повсюду использовались одни и те же входные переменные. Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступны на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys), за исключением панели (G), которые приведены в таблице S5. E - эмбриональный день; ГБ, гигабайты; Mpx, мегапиксели; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки; RAM, оперативная память.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000388.g004

Мы подтверждаем, что все методы хорошо работают для сегментации ядер в бластоцистах, в которых ядра обычно имеют почти сферическую форму в самой плотной области (внутренняя клеточная масса [ICM]) или хорошо разделены (трофэктодерма. [TE]). Тем не менее, Nessys достиг точности около 95% или выше и вспомнил, где другие методы не дали удовлетворительных результатов (рис. 4A). В частности, наибольшее расхождение наблюдалось для изображений клеток, выращенных в культуре (монослой и ацинусы), в которых клетки часто бывают плоскими, перекрывающимися и очень неоднородными по форме.

Сводка количества ошибок, показанная на (Рис. 4B), подтверждает этот анализ. Важно отметить, что сбалансированные пропорции явлений недостаточной и избыточной сегментации и минимальная доля пропущенных или ложных событий служат хорошим показателем того, что переменные были должным образом скорректированы для всех методов (под « ложными » мы подразумеваем ядра, сгенерированные автоматическим методом, которые не существуют в GT).

В конечном счете, цель автоматизированной ядерной сегментации — удовлетворить потребность в количественной оценке биологически значимых характеристик.Таким образом, мы затем оценили отклонение автоматизированных методов от GT в распределении сгенерированных функций, связанных с формой, интенсивностью или соседством (рис. 4C).

Одним из наиболее частых применений автоматизированной сегментации в биологии является ее использование для создания профилей экспрессии генов, подобного сортировке клеток с активацией флуоресценции (FACS), на основе данных иммунофлуоресценции, т.е. количественной иммунофлуоресценции [24–29]. Чтобы проверить производительность в этом аспекте, мы смоделировали сигнал от 3 гетерогенно выраженных факторов транскрипции и вычислили расстояние от интенсивностей GT (см. S1 Text, раздел B3).Мы заметили, что Nessys, Ilastik и MINS работали аналогично со средним значением распределения расстояния до 20 произвольных единиц флуоресценции (AFU). Это было интересное наблюдение, показывающее, что измерение интенсивности было относительно устойчивым к ошибкам сегментации — в частности, количество ошибок MINS было больше во всех биологических образцах и отклонение индекса Жаккара (JI) от GT (рис. 4C), тогда как JI Nessys было наиболее близким к GT.

Особенности формы ядра особенно важны при изучении морфогенеза [2,30–35].По этой причине мы вычислили анизотропию формы и угол между главной осью наиболее подходящего эллипсоида для обнаруженной формы и соответствующей ей формы GT. В этом случае ошибки сегментации были гораздо менее прощающими; только Nessys и Ilastik показали удовлетворительные результаты; и при рассмотрении результатов для отдельных биологических образцов эти характеристики отличались от GT для Ilastik, когда сегментация Ilastik приводила к наибольшему количеству ошибок (Monolayer and acini, S5 Fig).

Мы также оценили производительность по обнаружению числа соседей, так как эта функция может быть особенно актуальной при изучении коллективной организации клеток в различных контекстах [36–41].Опять же, только Ilastik и Nessys дали точное количество соседей со стандартным отклонением 2,2 соседей от GT. Это можно объяснить особой способностью Nessys и Ilastik точно определять положение центроидов форм и приводить к формам с более высоким JI, чем другие методы (идентификация соседства использует как центроиды, так и форму ядер; см. Рис. 4C внизу справа. изображение и раздел B.3 в S1 Text).

В целом, наши данные дают обзор уровня точности, который можно ожидать от сегментации Nessys по биологически значимым характеристикам, и мы делаем вывод, что Nessys является удовлетворительным методом для приложений, включающих измерение интенсивности, анизотропии, полярности и соседнего анализа.

Наконец, мы решили проблему ограничения времени обработки для больших изображений. Используя настольный компьютер с 64 ГБ оперативной памяти (ОЗУ), ни один метод, кроме Nessys, не смог обработать изображения размером более 2 ГБ в наших руках, тогда как Nessys смог обработать набор данных покадровых изображений из более чем 120 ГБ. Это свойство Nessys было задействовано базовой библиотекой ввода-вывода SCIFIO [42] и структурой изображений ImgLib2 [43], которая позволяла обрабатывать каждый временной кадр последовательно и обрабатывала изображения большего размера, чем память.Ограничения обработки зависят от доступных вычислительных ресурсов, но Nessys имеет то преимущество, что позволяет использовать обычный лабораторный компьютер для сегментации больших изображений.

Некоторые из протестированных нами методов не смогли завершить сегментацию (рис. 4D) или привели к чрезмерно долгому времени сегментации, когда изображения были больше 200 МБ; поэтому мы сообщаем время обработки для методов, отличных от Nessys, только для обрезки изображений <200 МБ (рис. 4E и таблица S6). Хотя в некоторых случаях время обработки было короче, чем с Nessys, Nessys в среднем был быстрее, чем другие методы и никогда не превышал время обработки 132 с, в то время как максимальное время обработки составило 251, 660 и 702 с для Ilastik, Farsight, и MINS соответственно (рис. 4E).

Мы заметили, что при использовании других методов время обработки увеличивалось пропорционально размеру изображения, чего не было в случае с Nessys (таблица S6). Чтобы исследовать этот аспект, и поскольку Nessys был способен сегментировать большие изображения, мы искусственно изменили размер изображения E8.75, изменяя размер или количество плоскостей изображения. Мы заметили, что время, необходимое для сегментации каждого ядра, оставалось постоянным независимо от размера изображения, в среднем 40 ядер в секунду для набора переменных, используемых в этом эксперименте (рис. 4F и 4G).Другими словами, время обработки Nessys увеличивается линейно с количеством ядер в изображении, а не с размером изображения. Это свойство можно объяснить тем фактом, что Nessys использует только 2 фильтра изображения, которые должны работать с каждым вокселем изображения, и эти фильтры работают параллельно на отдельных 2D-плоскостях. Последующие шаги работают с обнаруженными максимумами, количество которых пропорционально количеству ядер на изображении.

В целом мы пришли к выводу, что Nessys особенно хорошо работает с большими изображениями и трехмерными изображениями, содержащими переполненные ядра, и представляет собой полезное дополнение к набору инструментов подходов к сегментации, доступных в настоящее время.

Влияние качества изображения на точность Nessys

Затем мы решили задокументировать, как качество изображения может повлиять на точность Nessys (S6 – S8 рис.).

По своей конструкции Nessys может обрабатывать широкий диапазон интенсивностей ядер, что продемонстрировано сегментацией Nessys на изображении E8.75, на котором сильное падение интенсивности флуоресценции видно в более глубоких слоях ткани (рис. 1 и рис. S6A). Тем не менее, чтобы оценить отношение сигнал / шум, которое могло бы привести к отказу Nessys, мы постепенно увеличили количество (гауссовского) шума и повторно сегментировали изображение, используя одни и те же переменные (S6B, рис.).Мы наблюдали лишь небольшое влияние шума на точность, пока шум не достиг стандартного отклонения 300, а затем точность начала значительно снижаться (S6C и S6D, рис.). Однако мы могли бы спасти точность самого зашумленного изображения, добавив 5 «зашумленных форм» к обучающему набору классификатора и применив сглаживание изображения, включенное в качестве дополнительного шага в Nessys (рис. S6C и S6D и текст S1, раздел C.1).

Затем мы решили определить, как частота дискретизации по оси z может повлиять на точность Nessys.Для этого мы повторно дискретизировали изображение зоны 1 E8.75, чтобы создать серию изображений с размером шага z в диапазоне от 0,5 мкм до 5 мкм. Затем мы сегментировали все изображения, используя те же переменные, за исключением минимального и максимального объема, которые мы соответствующим образом скорректировали (S1 Text, раздел C.2).

Мы обнаружили, что в этом конкретном случае точность начала падать при размере шага z выше 1,2 мкм (что соответствует в среднем примерно 6 оптическим срезам на ядро). Этот результат показывает, что Nessys не особенно устойчив к большим шагам z .Однако этот предел является разумным, поскольку такое разрешение обычно достижимо с помощью стандартного конфокального микроскопа. Этот результат также показывает, как на этапе привязки 3D фиксируется информация 3D для исправления ошибок сегментации 2D.

Наконец, мы проверили влияние битовой глубины на результаты Nessys. Мы преобразовали 2 из наших 12-битных изображений в 8-битные изображения и повторно сегментировали изображения с помощью Nessys (S8 Fig и S1 Text section C.3). К нашему удивлению, битовая глубина никак не повлияла на результаты Nessys.Важно отметить, что мы использовали один и тот же классификатор как для 12-битных, так и для 8-битных изображений. Единственной переменной, требующей изменения, был порог задачи обнаружения максимумов. Если последующие приложения не требуют 12-битного диапазона интенсивности, это может быть большим преимуществом для уменьшения размера файла изображения.

В целом, наши данные показывают, что Nessys устойчив к шуму и может использоваться на образцах с широкими вариациями интенсивности ядер и с разрешением изображения, которое обычно достижимо с помощью стандартного лабораторного оборудования для визуализации.

Измерение экспрессии генов и морфологических особенностей у постимплантационных эмбрионов

Чтобы проиллюстрировать полезность сегментации Nessys и связанного с ней 3D-рисовальщика для изучения крупных эмбрионов, мы использовали эмбрионы мыши, которые были сконструированы для экспрессии Венеры под контролем регуляторных элементов Tcf15, фактора транскрипции, который отмечает образование сомитов [44]. Сигнал репортера Tcf15-Venus включен в изображение E8.75 набора данных DISCEPTS.Используя сегментацию Nessys на полном изображении, мы построили график зависимости средней интенсивности Tcf15 на ядро ​​от положения ядер вдоль оси AP эмбриона (рис. 5A). Мы наблюдали, что во фракции клеток, которые экспрессировали более высокие уровни Tcf15, чем в среднем (> 1000 AFU), были четко видны несколько кластеров точек вдоль оси AP. Используя программу рисования Nessys 3D для ручного аннотирования отдельных сомитов, а также других анатомических ориентиров (рис. 5B, 5C и 5D), мы подтвердили, что эти группы точек отражают пространственную организацию сомитов.

Рис. 5. Количественный анализ экспрессии Tcf15 в сложном эмбрионе мыши E8.75.

(A) Диаграмма рассеяния средней интенсивности Tcf15-Венера внутри клетки в зависимости от положения клетки по сагиттальной координате X. Границы между сомитами видны как промежутки между группами клеток с высоким уровнем Tcf15. (B) То же, что (A), за исключением того, что точки имеют цветовую кодировку в соответствии с их соответствующей эмбриональной областью, как показано на (D). (C) 3D-рендеринг всех обнаруженных ядер на изображении эмбриона мыши E8.75.Тепловая карта относительной интенсивности Tcf15-venus показана только для хвостовой почки и сомитных областей; остальные регионы показаны серым цветом. (D) 3D-рендеринг ядер, сгруппированных по эмбриональным областям. Масштабная линейка в (C) и (D): 100 мкм. Желтый пунктирный контур очерчивает форму зародыша. Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступны на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys). AFU, произвольные единицы флуоресценции; E — эмбриональный день; Tcf15, фактор транскрипции 15.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g005

Известно, что Tcf15 экспрессируется в сомитах, но ранее не сообщалось об анализе при разрешении отдельных клеток. Мы наблюдаем постепенное увеличение флуоресценции Tcf15-Venus по мере старения сомитов, достигая пика на седьмом старейшем сомите (S3), после чего экспрессия резко снижается в самых старых сомитах S1–2 (Рис. 5A, 5B и 5C). Примечательно, что низкие уровни экспрессии также были обнаружены в пресомитной мезодерме до образования первого сомита.Мы также наблюдаем, что экспрессия Tcf15-Venus обнаруживает значительную неоднородность внутри каждого сомита.

Этот анализ показывает, как комбинацию инструмента сегментации Nessys и 3D-аннотации можно использовать для количественной оценки больших многомерных изображений сложных эмбрионов с хорошей точностью и в разумные сроки.

Флуоресцентный репортер NE для автоматического отслеживания живых клеток

Затем мы решили пометить сетевой элемент в живых ячейках, чтобы использовать возможности сегментации Nessys в качестве входных данных для отслеживания ячеек.

В то время как живые маркеры всего ядра хорошо охарактеризованы (например, h3B – флуоресцентный белок [FP] [45] и FP – сигнал ядерной локализации [NLS] [46]) обычно используются для отслеживания клеток [10,14,21, 33,47–49]), это не относится к маркерам NE.

Идеальный живой репортер должен быть ярким, точно локализованным и не нарушать функцию клеток при конститутивной экспрессии. Хорошо известно, что ламины регулируют функцию клеток, и даже небольшие изменения в их последовательности или уровнях экспрессии могут иметь пагубные последствия [11,50].Сходным образом флуоресцентная маркировка др. Ассоциированных с NE белков может нарушать функцию NE и влиять на функцию клеток [51]. Учитывая эти соображения, мы создали NE-mKate2, химерную конструкцию, состоящую из яркого mKate2 FP [52], связанного с NLS и прикрепленного к однопроходному трансмембранному домену Emerin (EMD) [53]. Мы предположили, что эта конструкция будет постоянно импортироваться в ядро, будучи привязанной к внутримембранной сети клеток (Рис. 6). В самом деле, случайная интеграция NE-mKate2, управляемая промотором CAGS [54], в мышиные ES клетки приводила к яркому сигналу с устойчивой локализацией на краю ядра (Fig 6).Поскольку эта конструкция лишена какого-либо известного мотива взаимодействия с белками, кроме NLS, мы ожидаем, что этот белок будет инертным по отношению к функции клетки. Примечательно, что мы подтвердили, что ES-клетки NE-mKate2 способны вносить вклад с высокой эффективностью в химерные эмбрионы, указывая на то, что флуоресцентная метка не оказывает очевидного вредного воздействия на клетки [55]. В заключение, конструкция NE-mKate2 представляет собой новый неразрушающий флуоресцентный репортер для обнаружения NE в живых клетках.

Рис. 6. Новый синтетический флуоресцентный белок NE для отслеживания живых клеток.

(A) Схема, представляющая структуру живого репортера NE и его предполагаемую топологию и локализацию в клетках. (B) Конфокальное изображение с высоким разрешением, показывающее локализацию репортера в стабильной клеточной линии, конститутивно экспрессирующей репортер. EMD-TM, 44 C-ter аминокислоты из человеческого белка Emerin (UniprotKB: P50402), которые содержат трансмембранный домен; ER, эндоплазматический ретикулум; (GS) ₃ , линкер Gly-Ser; NE, ядерная оболочка; NLS, сигнал ядерной локализации.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g006

Отслеживание межклеточных взаимодействий во время дифференцировки плюрипотентных клеток

Чтобы изучить полезность наших инструментов для идентификации клеток в наборах данных с интервальной съемкой, мы выполнили конфокальную живую визуализацию плюрипотентных клеток, дифференцирующихся в нейронные клетки. Мы использовали мышиные ES клетки, содержащие репортер фактора транскрипции SRY-box 1 (Sox1) –зеленый флуоресцентный белок (GFP) [56], чтобы обнаружить Sox1 + нейральные предшественники по мере их появления с течением времени (Рис. 7A, S3 Movie).Мы выбрали эту систему, потому что в течение первых нескольких дней этого процесса плоские клетки образуют плотные трехмерные кластеры, в которых становится трудно различить отдельные клетки (рис. 7A). Примечательно, что состояние нейронной монослойной культуры было одним из самых сложных наборов данных для сегментации в соответствии с нашими результатами сравнительного анализа (рис. 4A и 4B).

Рис. 7. Анализ происхождения и обмена соседями показывает, что смешению клеток способствует деление над эпителиальной плоскостью.

(A) Увеличенные снимки одного оптического среза z S3 Movie.Звездочкой обозначена ячейка, движущаяся под яркой вытянутой ячейкой. Стрелка показывает заднюю сторону движущейся ячейки. Время отображается как ЧЧ: ММ. (B) Один кадр из покадрового эксперимента Sox1. Отдельные треки накладываются поверх сигналов mKate2 (зеленый) и Sox1 (красный). Точки указывают текущее положение обнаруженных ячеек. Расположение снимков, показанных в (A), обозначено желтым квадратом. (C) Схема, представляющая различные части дерева родословной и цветовой код, используемый для классификации.(D-E) Вафельные диаграммы, представляющие судьбу отдельной ветви линии передачи либо с точки зрения апоптоза, выживания или деления (D), либо с точки зрения идентичности Sox1 (E). Каждый квадрат представляет одну ветвь в наборе данных. (F-G) Вафельные диаграммы, сравнивающие судьбу сестринских ветвей по выживанию (F) или по дифференциации (G). (H) Графики Beeswarm-box, показывающие координату z или анизотропию делящихся и неделящихся ядер. (I) Графики Beeswarm-box, показывающие логарифм ₂ отношения материнской ветви к дочерним ветвям средней скорости или соседнего обменного курса.(J) Репрезентативная дорожка (желтая), содержащая деление над эпителиальной плоскостью, что приводит к большей скорости обмена между соседями после деления (белые точки представляют другие обнаруженные клетки на изображении). Соответствующие деревья с цветовой кодировкой, основанные на координате z или скорости обмена соседей, показаны под изображениями (промежутки в дереве соответствуют временным кадрам, в течение которых ячейка не была обнаружена). Обратите внимание на высокую координату z при делении и увеличение скорости обмена между соседями после деления.Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступны на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys). GFP, зеленый флуоресцентный белок; Sox1, фактор транскрипции SRY-бокса 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.g007

Хотя существуют отличные инструменты для автоматического отслеживания двумерных культур в реальном времени [37,57–60], описанную здесь ситуацию невозможно решить с помощью эти инструменты из-за склонности дифференцирующихся мышиных ES-клеток сдавливаться друг под другом (Рис. 7A и S3 Movie), что делает необходимым выполнение анализа в 3-х измерениях.

Одним из возможных подходов к решению этой сложной ситуации было бы выполнение мозаичного мечения, чтобы упростить отслеживание нескольких флуоресцентных клеток среди преимущественно немеченых клеток. Этого было бы достаточно для выделения подмножества клеточных клонов, но не удалось бы уловить локальные межклеточные взаимодействия или более широкий многоклеточный контекст, окружающий каждую клетку, оба из которых являются центральными для понимания возникающих свойств дифференцирующихся популяций [37,41]. По этой причине мы решили пометить все клетки Sox1-GFP с помощью нашей конструкции NE-mKate2, чтобы проанализировать коллективное поведение дифференцирующихся клеток в 3D.

В отличие от моментальных снимков, в которых Nessys сегментировал ячейки с высокой точностью без вмешательства пользователя, отслеживание этого сложного покадрового изображения требовало значительной ручной коррекции. Однако сегментация Nessys плюс ручная коррекция может быть комфортно завершена в течение 1 дня (примерно 7 часов), тогда как ручная сегментация всего набора данных займет около 70 часов (220 временных точек, в среднем 30 ячеек на кадр и со скоростью 100 ячеек, сегментированных в час).После сегментации каждого отдельного кадра мы запустили базовый трекер (S1 Text, раздел E.2) и смогли получить точные деревья происхождения (Рис. 7B и 7C, S3 Movie).

Мы сначала отслеживали скорость гибели клеток, выживаемость клеток, деление клеток (рис. 7D) и дифференцировку (рис. 7E). Интересно, что когда мы сравнивали судьбу сестринских клеток, мы наблюдали, что большинство сестринских пар подверглось одинаковой судьбе с точки зрения выживания (Рис. 7F), и что все они подверглись одинаковой судьбе с точки зрения дифференцировки (Рис. 7G).Это наблюдение согласуется с идеей, что решения о дифференцировке могут приниматься за несколько поколений до того, как репортеры клеточной судьбы станут детектируемыми [61,62].

Затем мы отслеживали инциденты обмена между соседями (текст S1, раздел E2.1), используя возможности Nessys и связанных инструментов для отслеживания положения ячеек в 3D. Считается, что обмен соседями часто происходит в эпибласте мыши, но неизвестно, в какой степени этот процесс влияет на распределение дифференцирующихся клеток в культуре.

Мы предположили, что основной вклад в обмен соседями будет положением делений по отношению к плоскости роста клеток. Действительно, когда мы исследовали трехмерную организацию клеток с течением времени, мы заметили, что координата z клеток увеличивалась при делении клеток (анизотропия немного уменьшалась, как и ожидалось; однако изменение координаты z не коррелировало с изменение толщины ячейки, рис. 7H). Это повысило вероятность того, что по мере того, как клетки делятся над другими клетками, дочерние клетки будут реинтегрироваться в колонию в разных местах, таким образом приобретая новых соседей.Чтобы измерить это, мы установили порог координаты z , выше которого деления считались происходящими над плоскостью, и мы классифицировали родословные соответственно (S1 Текст, раздел E2.2). Затем мы сравнили скорость обмена между соседями, происходящую до деления и после деления, и заметили, что, когда ячейки делятся над плоскостью (что составляет 33% от общего числа делений), скорость обмена между соседями с большей вероятностью увеличивается, таким образом подтверждая нашу гипотезу (рис. 7I).Примечательно, что мы подтвердили, что это наблюдение вряд ли можно объяснить изменением скорости клеток (рис. 7I справа). Раздел, представляющий это явление, показан на рис. 7J.

Хотя этот набор данных слишком мал, чтобы делать окончательные биологические выводы, он показывает, что в принципе можно использовать Nessys и связанные с ним инструменты для измерения положения каждой клетки в трех измерениях и оценки клеточного поведения этих клеток по отношению к их соседям. со временем, даже в сложных условиях, когда отдельные клетки плотно упакованы и их трудно различить на глаз.

Discussion

В этом исследовании мы намеревались изучить идею использования NE для ядерной сегментации в качестве альтернативы маркировке ДНК / хроматина. Эта идея была предложена более 15 лет назад, и предварительные результаты на небольших 2D-изображениях были многообещающими [63]. Однако, как ни странно, эта идея, насколько нам известно, еще не была пересмотрена для сложных наборов трехмерных данных. Здесь мы представляем Nessys, метод, предназначенный для автоматической сегментации ядер на основе NE. Мы показываем, что этот метод особенно хорошо работает для «сложных» наборов данных, в которых изображения содержат большой массив ядерных форм и размеров, а ядра перекрываются.Это также быстрый метод, который хорошо масштабируется для больших изображений. Далее мы обсуждаем сильные и слабые стороны нашего метода, а также резюмируем наши усилия, направленные на то, чтобы сделать метод простым для принятия сообществом, а также полезность инструментов и набора данных, которые мы предоставляем в этой статье.

Характеристики сигнала NE объясняют производительность Nessys

Для создания набора данных DISCEPTS мы сосредоточились на выборке ядер различной формы, размера, текстуры и трехмерной организации ткани. Собранные нами изображения служат хорошей иллюстрацией множества проблем, которые все еще необходимо решить в ядерной сегментации, и мы считаем, что этот набор данных будет полезен в качестве набора данных GT для целей сравнительного анализа.

Важно отметить, что этот набор данных показывает, что разные типы клеток обладают разной организацией хроматина, что приводит к очень неоднородному внешнему виду ядерного содержимого. Например, ядра нервных клеток содержат области с высоким сродством к DAPI, которые могут казаться случайным образом распределенными внутри ядра, в том числе на периферии. Это свойство может сбивать с толку методы, основанные на предположении, что более яркие области находятся в центре формы. Кроме того, границы ядер, которые являются ключевыми характеристиками для многих методов [2,5–7], становятся очень трудно различимыми даже на глаз.Этих проблем можно избежать при использовании окрашивания NE, и это частично объясняет успех метода Nessys. Ядерные границы остаются четкими, когда ядра, окрашенные NE, находятся в тесном контакте друг с другом (рис. 1B), и действительно, наши результаты показывают, что два метода, которые используют сигнал NE (Nessys и Ilastik), работали особенно хорошо для всех изображений эмбрионов. (Рис. 4A и 4B, таблица S4).

Одним из потенциальных недостатков сигнала NE является то, что внутреннюю часть ядра становится трудно отличить от внешней части ядра.Поскольку это различие легко достижимо человеческим глазом, Nessys использует наивный байесовский классификатор, обученный на небольшом подмножестве форм, чтобы исключить нерелевантные формы (межъядерные пространства). Эта классификация гарантирует, что для достижения правильной ядерной сегментации требуется только один канал, и оставляет другие цвета доступными для других целей. Это контрастирует с Ilastik, которому, согласно нашему анализу, для хорошей работы требовался канал DAPI.

Наши результаты также показали, что наибольшая разница с другими протестированными методами наблюдалась для изображений клеток, выращенных в культуре.Хотя эмбрионы млекопитающих считаются одной из самых сложных систем для сегментации [14,33,48], мы показываем, что дифференцирующиеся стволовые клетки в культуре могут быть одинаково, если не более трудными, для точного сегментирования, поскольку они имеют тенденцию перекрываться [64] и быть более плоскими и менее правильными по форме, чем их аналоги in vivo. Из-за падения разрешения по оси z и сигнала NE в верхней и нижней частях ядер даже Ilastik не смог разделить перекрывающиеся клетки (рис. 4A и 4B).Nessys работает хорошо, поскольку сначала полностью использует оптимальное разрешение xy , а затем использует стратегию раскраски графиков для связывания двухмерных фигур в трехмерные объемы.

Мы хотели бы подчеркнуть, что разные методы подходят для разных контекстов и что наш метод предназначен для дополнения, а не замены существующих методов, особенно хорошо подходит для сегментирования изображений со сложной трехмерной структурой ядер неправильной формы.

Наконец, чтобы завершить документирование возможностей Nessys, мы также протестировали способность Nessys сегментировать другие типы сигналов, обычно используемые в 2D-скрининге или 3D-анализе (рис. S9 и текст S1, раздел D).Наши результаты показывают, что, хотя Nessys не был разработан для сегментации ядер, окрашенных DAPI, мембранно-меченых клеток или изображений с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК), Nessys все же может обеспечить точные сегменты в этих ситуациях. Это демонстрирует, что наш подход может быть оптимизирован и для этих типов сигналов.

Применимость метода Nessys

Практичность использования NE вместо ядерного содержимого.

Красители для мечения ДНК просты в использовании и по этой причине широко используются для маркировки ядер клеток.Таких красителей для NE пока нет, поэтому использование Nessys требует, чтобы NE был окрашен антителами. Это может потенциально наложить ограничения на приложения из-за ограничений вида-хозяина. Мы использовали LaminB1, поскольку он, как известно, экспрессируется в большинстве типов клеток с минимальной межклеточной изменчивостью [65], но могут быть использованы и другие эпитопы NE: мы приводим в таблице S7 альтернативные антитела, которые обеспечивают аналогичные сигналы в наших руках. Использование нанотел может еще больше повысить практичность, уменьшить проблемы проникновения антител и быть более дружелюбным к животным, хотя мы сами не тестировали этот подход [66].

Мы также разработали NE Live Reporter для использования Nessys для покадровой визуализации (рис. 6 и 7). Учитывая, что доступно несколько простых подходов для маркировки сетевого элемента, мы ожидаем, что большинство пользователей смогут найти метод, подходящий для их собственной системы.

Удобство использования программного обеспечения.

Сообщество нуждается в открытом, хорошо документированном и простом в использовании программном обеспечении для ускорения количественных, воспроизводимых и совместных исследований [4,8,9].Чтобы соответствовать этой цели и облегчить внедрение Nessys, программное обеспечение является бесплатным и имеет открытый исходный код (https://framagit.org/pickcellslab/nessys), а процесс установки занимает всего пару минут и не требует особые знания в области вычислений. Nessys был протестирован в Linux, Windows и MacOS.

Видеоурок и документация по Nessys доступны в Интернете, а пользовательский интерфейс включает интерактивные инструменты для помощи в корректировке переменных (см. Также средство отслеживания проблем, которое позволяет оставлять комментарии от сообщества).Программное обеспечение и соответствующая документация будут продолжать улучшаться в ответ на отзывы пользователей. Долгосрочная цель — полностью устранить необходимость в корректировках переменных. Примечательно, что мы предполагаем возможность использования нескольких аннотированных томов с редактором Nessys в качестве обучающего набора для автоматической корректировки переменных.

Важным практическим аспектом Nessys является то, что он разработан, чтобы быть быстрым и избежать проблем, связанных с ограничением времени обработки на ячейку. Мы показали, что Nessys может производить точные результаты сегментации в разумные сроки даже для больших наборов данных на стандартной лабораторной рабочей станции (рис. 4).

Переносимость кода, расширяемость и будущая работа.

Мы разработали Nessys, используя передовой опыт разработки программного обеспечения. Например, в пользовательском интерфейсе используется модульный шаблон мастера, так что отдельные подзадачи могут быть улучшены без изменения других. Это будет способствовать дальнейшим улучшениям метода. Такие улучшения могут включать замену последнего этапа морфологической фильтрации современным методом уточнения формы [67] или использование более сложных классификаторов [68] во время процесса ранжирования формы для дальнейшего повышения точности.Дальнейшая работа также будет сосредоточена на улучшении визуализации качества сегментации, чтобы ускорить процесс редактирования сегментации, например, путем включения цветовой карты оценки достоверности сегментации, как описано в [69].

Nessys изначально разрабатывался как модуль для нашей собственной инфраструктуры, но спроектирован так, чтобы его можно было переносить на другие платформы общего назначения, такие как ImageJ [70] или Icy [71].

Это поможет связать наш метод с другими мощными компонентами анализа изображений.Например, использование метода восстановления изображения, такого как CARE [72] перед сегментацией Nessys вместе с последующими сложными методами отслеживания [10,49], приблизит нас на шаг к цели регистрации и исследования возникающих свойств коллективной организации ячейки в контексте.

В заключение, мы надеемся, что представленные здесь инструменты будут способствовать ускорению количественных исследований. Мы предлагаем надежный метод трехмерной ядерной сегментации вместе с трехмерным редактором.Программное обеспечение легко установить как отдельное приложение и предназначено для переноса на фреймворки общего назначения, такие как ImageJ. Мы также предоставляем набор данных и служебную программу для тестирования производительности сегментации в надежде, что они будут полезны сообществу. Эти инструменты бесплатны, имеют открытый исходный код и предназначены для работы на стандартном лабораторном компьютере с наборами данных, созданными с помощью обычных микроскопов.

Материалы и методы

Заявление об этике

Эксперименты на животных проводились в соответствии с лицензией на проект Министерства внутренних дел Великобритании PEEC9E359, одобренной Комиссией по надзору за благополучием и этикой животных Эдинбургского университета и в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года.

Разработка и доступность программного обеспечения

Nessys и связанные программы написаны на Java. Наши программы зависят только от библиотек с открытым исходным кодом. К ним относятся ImgLib2 [43] для структуры данных изображения и SCIFIO [42] и BioFormats [73] для ввода / вывода изображения. Мы разработали наш код в Eclipse March 0.3 (https://www.eclipse.org/). Зависимости управляются с помощью Maven, а контроль версий — с помощью Git. Исходный код доступен на GitLab в Framasoft (https://framagit.org/pickcellslab/nessys).

Детали реализации, исходный код и пользовательская документация могут быть изменены по мере того, как мы продолжаем улучшать программное обеспечение. Исходный код и обновленную документацию можно найти в нашем репозитории GitLab, размещенном на Framasoft (https://framagit.org/pickcellslab/nessys). Мы создали тег Git «v0.1.0», чтобы пометить фиксацию, которая соответствует версии программного обеспечения, которое использовалось для этой публикации.

Культура клеток ES

Все линии ES-клеток мыши обычно поддерживали в желатинизированных (Gelatin, Sigma) сосудах для культивирования (Corning) в Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM, Sigma) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, APS), 100 Ед / мл LIF ( собственного производства), 100 нМ 2-меркаптоэтанола (Gibco), 1X заменимые аминокислоты (Gibco), 2 мМ L-глутамин (Gibco), 1 мМ пируват натрия (Gibco).Для культуры 2i-LIF [74] клетки поддерживали в среде N2B27 с добавлением 3 мкМ Chiron и 1 мкМ PD0325911. N2B27 состоит из среды DMEM / F12 и Neurobasal в соотношении 1: 1 с добавлением 0,5% модифицированного N ₂ , 0,5% B27 и 2-β меркаптоэтанола (все от Invitrogen). Культуру клеток поддерживали при 37 ° C с 5% CO ₂ и регулярно тестировали на загрязнение микоплазмами.

Дифференциация монослоя нейронов

Sox1-GFP ES клетки [56] сначала дифференцировали в EpiSC в соответствии с протоколом, описанным в [75], а затем далее дифференцировали в нервные розетки следующим образом: конфлюэнтную культуру EpiSC разводили 1/40 и высевали на чашки, покрытые фактором роста. — восстановленный матригель (Corning) в среде N2B27, содержащей 10 мкМ SB435215.Среду заменяли каждый день, и клетки пассировали каждые 2 дня в соотношении от 1: 3 до 1: 6 на покрытые матригелем чашки до тех пор, пока нервные розетки не стали отчетливо видны (5 дней). При последнем пассаже клетки снова высевали на покровные стекла толщиной 12 мм, покрытые матригелем, и фиксировали для иммуноокрашивания через 2 дня культивирования.

Acini / 3D клеточная культура

E14tg2 альфа-ES-клеток дикого типа, Tcf15-Het-клетки и Tcf15-KO-ES-клетки (Lin, Tatar et al., В процессе подготовки) были использованы для этого набора данных (включены названия клеточных линий, используемых для данного изображения. в названии изображения).Клетки поддерживали в условиях 2i-LIF, а затем высевали на покрытые матригелем чашки в среду N2B27 / 1% KSR с добавлением 12 нг bFgf и 20 нг активина A, как описано в [76], и содержащей 600 мкг / мл Фактор роста — восстановленный матригель, чтобы вызвать образование трехмерных структур. Клетки фиксировали для иммуноокрашивания на 2 день индукции EpiLC.

Штаммы мышей, стадирование и разведение

Беспородных мышей MF1 дикого типа и трансгенных мышей — Tcf15-Venus содержали в цикле 12 часов света / 12 часов темноты.Для спариваний по времени полдень в день обнаружения вагинальной пробки был обозначен как E0.5. Определение стадии ранних эмбрионов мышей проводили согласно [77, 78].

Для создания линий мышей Tcf15-Venus, ES-клетки Tcf15-Venus были созданы на фоне E14tg2a путем замены первого экзона Tcf15 кодирующей последовательностью для Венеры. Нацеливающая конструкция для Tcf15 содержала плечо 5′-гомологии размером 2,3 т.п.н. и плечо 3′-гомологии 2,4 т.п.н., соответствующие последовательностям, фланкирующим первый кодирующий экзон Tcf15.Внутри двух плеч гомологии находится кодирующая последовательность для Венеры, за которой следует кассета для отбора кассеты pgk-neo MC1-TK, фланкированная frt. Эту кассету удалили путем трансфекции pFlpO после выделения успешно нацеленных клональных клеточных линий. Кассету PGK-DTA помещали перед плечом 5′-гомологии, чтобы сделать возможным отрицательный отбор клонов, в которые нацеливающая кассета была интегрирована случайным образом. Гетерозиготные клетки Tcf15 ES использовали для получения химерных мышей зародышевой линии, которых затем подвергали обратному скрещиванию в течение нескольких поколений на фоне Bl / 6.

Сбор и вскрытие эмбрионов

Для бластоцист эмбрионы были получены на стадии 8-клеточной морулы путем промывки яйцеводов E2.5 средой M2 (Sigma). Пеллюцидную зону удаляли кратковременной промывкой в ​​растворе Acid Tyrode’s (Sigma) при комнатной температуре. Эмбрионы культивировали в среде KSOM (LifeGlobal) при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 24 часов до иммуноокрашивания. Эмбрионы E7.5 и E8.75 выделяли из децидуальной оболочки в среде M2, и мембрану Райхерта удаляли перед фиксацией и иммуноокрашиванием.

Иммунофлуоресценция, осветление эмбрионов и визуализация

Образцы фиксировали в 4% формальдегиде / PBS / 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин (клеточные культуры) или 30 мин (эмбрионы) при комнатной температуре. Для крупных эмбрионов фиксатор гасили 100 мМ глицином / PBS в течение 5 мин. После 3 последовательных промываний PBS / Triton образцы инкубировали в течение минимум 30 минут (культура клеток) или в течение ночи (эмбрионы) с блокирующим раствором, который состоял из 5% ослиной сыворотки (Sigma), 0,1% Triton X-100 (Sigma ) и 0.03% азид натрия (Sigma) в PBS. Инкубацию с антителами проводили в течение 1 ч (клетки) или в течение ночи при комнатной температуре (> E7.0 эмбрионы) или при 4 ° C (бластоцисты). Все антитела разводили в блокирующем растворе. Антитела, используемые для каждого изображения, приведены в таблице S1, а разведения и эталоны перечислены в таблице S7. Образцы контрастировали с 1 мкг / мл DAPI (Sigma), разведенным в PBS в течение 10 минут (клетки и бластоцисты) или 30 минут (> E7.0 эмбрионы) при комнатной температуре. Клетки, выращенные на покровных стеклах, помещали в ProLong Gold Antifade Mountant (Molecular Probes) за 24 часа до визуализации.Эмбрионы E7.5 и E8.75 были дополнительно осветлены с использованием метода на основе бензилового спирта / бензилбензоата (BABB), адаптированного из [79]. Вкратце, эмбрионы дегидратировали в серии градуированных метанолов (25%, 50%, 75%, 90%, 100% дважды) по 5 минут каждая. Затем эмбрионы переносили в раствор BABB / метанол 1: 1 на 5 мин перед окончательным переносом в чистый раствор BABB внутри металлической камеры со стеклянным дном для визуализации. Бластоцисты помещали на каплю 10 мкл PBS, покрытую минеральным маслом (Sigma), в металлической камере со стеклянным дном.Микроскоп и объективы, используемые для визуализации, перечислены в таблице S1.

Методы сегментации: версии, переменные корректировки и сравнительный анализ

64-разрядные версии Ilastik (версия 1.1.9), Farsight Linux (версия 0.4.4) и Nessys (v0.1.0) были протестированы на настольном компьютере (i7 6700K 8-ядерный процессор, 64 ГБ ОЗУ и жесткий диск 7200 об / мин) под управлением Linux Opensuse Leap 42.3. MINS (версия 1.3) запускалась на том же компьютере, но в ОС Windows 8 с Matlab (версия R2016a 9.0.0.341360).

Чтобы получить наилучший возможный результат сегментации для каждого протестированного метода, мы следовали рекомендациям, доступным для каждого инструмента (http://katlab-tools.org/, https://github.com/RoysamLab/Farsight-toolkit, https: //www.ilastik.org/documentation/index.html). Для Nessys, MINS и Farsight мы проверили 5 попыток сегментации с различными наборами переменных и сохранили результат, в результате чего был получен лучший F-показатель по сравнению с GT (таблица S4). Для Ilastik мы сначала обучили классификатор пикселей на каналах LaminB1 и DAPI распознавать 3 класса пикселей: фон, ядерное содержимое и «межъядерное пространство» (включая ось z ), которое часто состояло из яркого сигнала LaminB1.Использование этого метода значительно улучшило способность Ilastik разделять соприкасающиеся ядра на последующих этапах. Затем мы протестировали 5 наборов пороговых переменных и сохранили лучший результат сегментации, как объяснялось ранее.

Время обработки регистрировалось путем ручного запуска и остановки цифрового секундомера. Nessys также регистрировала время обработки в терминале. Farsight запускался из командной строки, а все остальные методы запускались из графического интерфейса.

Метрики, перечисленные в таблице S4, обобщенные на рис. 4A и 4B, и карты ошибок, показанные на рис. 3, были рассчитаны с помощью нашей программы сравнения сегментации (рис. S4), а морфометрические измерения, показанные на рис. 4C и S5 рис., Были рассчитаны в PickCells (https: // pickcellslab.frama.io/docs/), как подробно описано в S1 Text.

Репортерная конструкция NE и клеточная линия

Для создания репортера NE мы использовали сборку Гибсона для лигирования фрагмента NLS-mKate2 и трансмембранного домена EMD человека (нуклеотиды 878–1 012 NM_000117.2) ниже промотора CAGS, включенного в основную цепь, содержащую устойчивость к гигромицину. mKate2-NLS амплифицировали с помощью ПЦР из pTEC20, подаренного Лалитой Рамакришнан ([80] плазмида Addgene № 30179; http://n2t.net/addgene:30179; RRID: Addgene_30179), а последовательность EMD амплифицировали с помощью ПЦР из полноразмерная плазмида человека, содержащая EMD (любезный подарок от доктора Э.Ширмер). Линкерные последовательности NLS и (GS) ₃ были включены в выступающие части праймеров.

Полученная плазмида была подтверждена полным секвенированием вставки и будет депонирована в Addgene.

Для создания линии двойных репортерных клеток Sox1-GFP / mKate-NE мы липофектировали 2,5 мкг плазмиды (Lipofectamin 3000, Thermofischer) в соответствии с рекомендациями производителя в клеточную линию Sox1-GFP [54]. Клоны, устойчивые к гигромицину, были выбраны для наилучшего компромисса между высокой интенсивностью mKate2 и правильной локализацией трансгена в NE.

Покадровая съемка и отслеживание

Для эксперимента по отслеживанию линия клеток sox1-gfp / NE-mKate2 поддерживалась в состоянии 2i / LIF, а затем дифференцировалась в нейронный клон следующим образом: клетки диссоциировали с помощью аккутазы (Invitrogen) и повторно помещали при плотности 10000 клеток. / см ² в среду N2B27 / 1% KSR. Мы определили, что Sox1-GFP стал экспрессироваться между 2-м и 3-м днем ​​дифференцировки, и таким образом заменили клетки на 2-й день дифференцировки в среду N2B27 / 1% KSR без фенола внутри металлической камеры со стеклянным дном для визуализации.Визуализацию выполняли с помощью инвертированного микроскопа Leica Sp8 TCS с использованием контроля температуры и CO ₂ (5%), 20-кратного объектива с NA = 0,7 и иммерсионного раствора глицерина. Лазеры возбуждения имели длину 488 нм и 561 нм, а сигнал регистрировался детекторами HyD. Двадцать пять самолетов z были захвачены каждые 6 минут; Окончательное разрешение изображения составило 0,4 × 0,4 × 0,57 мкм. Процедура отслеживания и анализа описана в разделе C2 текста S1.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Подробное описание древовидной процедуры следования гребням.

Иллюстрация различных этапов древовидной процедуры следования гребням. Подробное описание рисунка доступно в S1 Текстовом разделе A1. (A) Обзор процедуры построения деревьев риджлетов. На всех диаграммах сигнал управляемой характеристики фильтра показан серыми линиями. Риджлеты показаны красным; выбранные в настоящий момент максимумы представлены желтыми кружками, точки пересечения — синими кружками, а точки листьев — зелеными кружками. Раздел «Следующее ребро на уровне пикселей» представляет движущееся ядро, в котором маленький квадрат представляет пиксель изображения.«Недопустимые» пиксели показаны красным крестиком, а «потенциальные» пиксели — знаком вопроса. (B) Иллюстрации условий остановки для 2 фаз процесса создания риджлета. Для фазы 2 нарисовано большое поле зрения с 3 ядрами. Уже построенные ветви дерева показаны красными штрихами; красный кружок рисуется в позиции корневого узла. Зеленые листья представлены там, где определены листовые узлы, а оранжевый лист нарисован там, где найдено пересечение путей, поскольку это вызывает появление нового дочернего листа в соответствующем внутреннем узле дерева.C — пересечение собственного пути; CP — точка пересечения родительского риджлета; D, дистанционная остановка; I — падение интенсивности; L, петля к себе; М, пропущено; О, происхождение; P — путь к родительскому узлу; Т, крутые повороты.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s001

(EPS)

S2 Рис. Создание формы и особенности формы.

(A) Принцип создания 2D-формы из дерева риджлетов. На схеме слева показано дерево риджлетов, корень которого показан синим цветом, гребни на листьях — зеленым и помечены буквами, а другие узлы риджлетов окрашены в желтый цвет.Справа нарисованы 6 фигур, которые можно создать из дерева. Двухбуквенный код в верхней части фигуры указывает комбинацию листьев, из которой она была построена. (B-C) Представления формы BC, показанной на (A), как она появляется на цифровом изображении, в котором каждый квадрат в сетке иллюстрирует пиксель. (B) 2 категории пикселей, используемые для расчета характеристик формы на основе интенсивности. (C) Соглашение о кодировании контура формы в виде цепочки, используемой для вычисления характеристик кривизны формы (левая панель).Рассчитанные уровни кривизны показаны на центральной панели, а классификация пикселей на выпуклые или вогнутые — на правой.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s002

(EPS)

S3 Рис. Описание процедуры привязки глубины и определение пользовательских переменных.

Схемы на этом рисунке представляют собой индивидуально сегментированные плоскости на трехмерном изображении. Плоскости изображения показаны пунктирными вертикальными линиями с двумерными областями, определенными на предыдущих этапах сегментации, нарисованными сплошными фигурами.Относительное положение каждой плоскости обозначается буквой P, за которой следует индекс плоскости. (A) Пример направленного графа, созданного на первом шаге процедуры. Стрелки обозначают связи, которые создаются, если две соединенные фигуры потенциально могут быть частью одного объема. (B) Необходимые условия для создания ссылки, когда области для поиска (синие фигуры) расположены в плоскости, непосредственно примыкающей к рассматриваемой области (оранжевая форма). На рисунке вверху показано максимальное пороговое значение межцентроидного расстояния в виде пунктирной окружности.Красный крест показывает центроиды, которые исключены, а зеленые галочки показывают центроид, который может быть включен. На нижнем рисунке показан эффект «порога перекрытия». Проценты показывают, какая часть области перекрывается с поверхностью другой области. Левый процент предназначен для синей формы, а правый процент — для оранжевой формы. Дан результат с двумя различными значениями порога перекрытия. (C) Условие для создания края, когда область для поиска (синяя фигура) расположена дальше, чем плоскость, непосредственно примыкающая к рассматриваемой области (оранжевая форма).Переменная «Max Jump» определяет максимальное количество плоскостей, которые разрешены между двумя областями для создания кромки. На чертеже также показано правило, которое применяется, когда область уже имеет край с областью на плоскости, расположенной выше по потоку. (D) Диаграммы, показывающие правила, применяемые при обнаружении «двусмысленности». Цвета фигур указывают на их уникальный идентификатор, а область неоднозначности отображается оранжевым цветом. Представлены два случая: (1) Неоднозначность обнаруживается как с плоскостью выше, так и с плоскостью ниже.В этом примере JI между объединенными областями выше и текущей областью выше, чем JI между объединенными областями ниже и текущей плоскостью. (2) Неоднозначность обнаруживается только в плоскости ниже. Результат, полученный в случае, когда JI между текущей областью и объединенными областями в нижней плоскости выше, чем JI между текущей областью и областью выше, показан справа. (E) Иллюстрация процедуры маркировки томов. Цифры в квадратах с закругленными углами указывают порядок событий.Цифры рядом с краями представляют значение JI между двумя соединенными областями. Каждый цвет обозначает уникальный идентификатор. Области с одинаковым идентификатором в конечном итоге будут принадлежать одному тому. Белый цвет означает, что идентификатор тома еще не назначен. Показан эффект «ограничения объема» (переменные максимального и минимального объема). (F) Иллюстрации дополнительных шагов постобработки. Левая панель: разделение на основе интенсивности. Показаны примеры плоскостей изображения с сигналом LaminB1. Соответствующая диаграмма показывает разрез, где находится пик в ИК-диапазоне (интенсивность в центре, деленная на интенсивность на краю).Средняя панель: Разделение на основе смещения — верхняя диаграмма показывает пример недостаточно сегментированного объема. Приведен профиль компакт-диска по глубине изображения. На нижнем рисунке разрез показан на пике значения CD. Правая панель: Сглаживание объема. Примеры артефактов приведены на верхней диаграмме. На нижнем рисунке показано, как предполагается исправить эти артефакты. Также показаны дополнительные области на концах тома. CD — смещение центра тяжести; ИК, соотношение интенсивностей; JI, индекс Жаккара.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s003

(EPS)

S4 Рис. Обзор функций Nessys для проверки сегментации и сравнительного анализа.

(A) Снимок первого окна, которое появляется при запуске автономного приложения Nessys. Это окно позволяет пользователю выбрать конкретный инструмент для работы. (B) Снимок интерфейса редактора сегментации. Область штрихов эмбриона E8.75 (сине-белое изображение) загружается в редактор вместе с результатом сегментации, который отображается в виде желтых контуров.Выбранные формы выделены красным. (C) Обзор инструмента «компаратор сегментации». Прямоугольники с заголовком на оранжевом фоне представляют реализации Java в приложении. Задачи, которые они решают, указаны внутри поля. Интерфейс «SegmentationComparator» показан в синем поле и может быть расширен для добавления пользовательских показателей в процесс тестирования (пунктирное поле). Необходимые входные данные показаны слева: изображение GT и протестированная сегментация загружаются в приложение, которое выполняет «сопоставление формы» и подсчет ошибок, а также вычисляет показатели производительности.Обратите внимание, что пакетная обработка изображений поддерживается, если количество и размеры изображений GT такие же, как у протестированных изображений сегментации. Выходные данные программы показаны в правой части диаграммы. Summary.tsv — это таблица со всеми рассчитанными метриками для каждого изображения. Необработанное изображение трехмерной карты ошибок, созданной программой, показано в справочной таблице «16 цветов» ImageJ (Image Map, слева) и трехмерном представлении этого изображения, полученном с помощью средства просмотра ImageJ 3D (Image Map, справа). Синий: точное попадание, желтый: ложное, фиолетовый: слияние, оранжевый: разделение.Онлайн-видеоуроки по методу Nessys легко доступны по адресу https://pickcellslab.frama.io/docs/use/features/segmentation/nessys/, а подробные руководства по всем инструментам Nessys скоро будут опубликованы на следующем веб-сайте: https : //pickcellslab.frama.io/docs/. E — эмбриональный день; GT, наземная правда; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s004

(EPS)

S6 Рис. Nessys устойчив к изменениям интенсивности флуоресценции и низкому отношению сигнал / шум.

(A) Изменение интенсивности и Nessys приводит к изображению зоны 1 E8.75 ( z срез 44). (B) Увеличенный вид зоны 1 E8.75 с увеличивающимся количеством гауссовского шума. (C-D) Точность Nessys с увеличением уровня шума, выраженного как точность, отзыв и F-мера (C) или в единицах топологических ошибок (D). Везде использовались одни и те же переменные, за исключением того, где указано «параметры настроены». Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступны на GitLab (https: // framagit.org / pickcellslab / data / 2019_nessys). E — эмбриональный день; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s006

(EPS)

S7 Рис. Более высокая частота дискретизации по оси

z помогает Nessys достичь высокой точности.

Точность Nessys с увеличением z — размеры шага, выраженные в терминах точности, отзыва и F-меры (A) или в терминах топологических ошибок (B). Размер шага z указан в мкм, а соответствующее среднее количество срезов z на ядро ​​показано ниже.Таблицы данных, в которых перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступны на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys). Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s007

(EPS)

S9 Рис. Nessys может сегментировать сигналы, не относящиеся к NE, с приемлемой точностью.

(A) Репрезентативные изображения (вверху) и результаты Nessys (внизу) для сигналов, не относящихся к NE. Источник набора данных / изображения указывается в скобках.Все изображения были воспроизведены здесь с явного разрешения авторов. (B-C) Точность Nessys для сигналов, не относящихся к NE, выраженная в терминах точности, отзыва и F-меры (A) или в терминах топологических ошибок (B). Таблица данных, в которой перечислены отдельные измерения, использованные для рисунка, доступна на GitLab (https://framagit.org/pickcellslab/data/2019_nessys). BBBC, Коллекция эталонных тестов Broad Bioimage; NE, ядерная оболочка; Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.3000388.s009

(EPS)

S2 Фильм. Иллюстрация процедуры следования гребня.

Это замедленный видеоролик о процедуре следования за гребнем. Фильм начинается с отображения последнего дерева, как описано в легенде на рис. 2. Зеленая часть дерева представляет пару листьев, выбранную как наиболее вероятную допустимую форму в соответствии с ранжированием, выполненным классификатором. Затем последовательность показывает, как было выращено дерево. Зеленая точка представляет местоположение процедуры следования гребням в данный момент времени, а синие линии выделяют гребни, которые уже были идентифицированы.Наконец, перед тем, как будет нарисована сегментированная область, подсвечиваются листья, корень и «выигрышный» гребень.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s011

(AVI)

S3 Фильм. Промежуток времени двухцветных репортерных клеток во время нейральной дифференцировки.

Видеозапись покадрового эксперимента, показанная на рис. 7. Зеленый: сигнал NE-mKate2, красный: Sox1-GFP; 1 сек = 38 мин в реальном времени. GFP, зеленый флуоресцентный белок; NE, ядерная оболочка; Sox1, фактор транскрипции SRY-box 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s012

(AVI)

S6 Таблица. Детали времени обработки Nessys с увеличением размера плоскости изображения или номера плоскости.

В этой таблице приведены сведения о времени обработки Nessys с увеличением размера плоскости изображения или номера плоскости. Nessys, Система сегментации ядерной оболочки.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000388.s018

(PDF)

Новые открытия в анатомии человека

В 16 веке, когда изучение анатомии человека еще только зарождалось, любопытные наблюдатели собирались в анатомических театрах, чтобы взглянуть на публичные вскрытия мертвых.За прошедшие с тех пор годы ученые тщательно нанесли на карту внутренние органы, кости, мышцы, нервы и многие другие компоненты нашего тела, так что человеческий труп больше не обладает тем же чувством тайны, которое раньше привлекало толпы.

Новые открытия в грубой анатомии — изучении структур тела на макроскопическом уровне — сейчас редки, а их значение часто преувеличено, — говорит Пол Нойманн, профессор, специализирующийся на истории медицины и анатомической номенклатуре в Университете Далхаузи.«Я думаю, что важные открытия в области анатомии теперь происходят в результате изучения тканей и клеток».

За последнее десятилетие было сделано несколько открытий, которые помогли опровергнуть предыдущие предположения и раскрыли новые взгляды на нашу анатомию. «Что действительно интересно и захватывающе во всех новых исследованиях, так это иллюстрация того, насколько новые технологии [микроскопии и визуализации] дают более глубокое понимание», — говорит Том Гиллингвотер, профессор анатомии Эдинбургского университета в Великобритании.«Я предполагаю, что многие из этих открытий являются началом, а не концом развивающегося взгляда на человеческое тело».

Вот примеры некоторых из этих открытий.

LAURIE O’KEEFE

Утечка мозгов

Лимфатическая система, сеть сосудов, отводящих жидкость и удаляющих отходы из тканей и органов по всему телу, долгое время считалась отсутствующей в мозге. Ранние сообщения о лимфатических сосудах в мозговых оболочках, оболочке, покрывающей мозг, датируются еще 18 веком, но эти результаты были встречены скептически.Только недавно эта точка зрения была опровергнута после сообщения 2015 года о лимфатических сосудах в мозговых оболочках мышей и открытия в 2012 году так называемой глимфатической системы, взаимосвязанной сети глиальных клеток, которая способствует циркуляции жидкости в мозге мыши. В 2017 году нейровизуализационные исследования выявили наличие таких лимфатических сосудов в мозговых оболочках человека.

LAURIE O’KEEFE

Пространства, заполненные жидкостью

В 2018 году исследователи сообщили, что пространство между клетками представляет собой заполненную коллагеном сеть, заполненную жидкостью, которую они назвали интерстиций.Они предположили, что это открытие, полученное в результате тщательного изучения тканей желчных протоков, мочевого пузыря, пищеварительного тракта и кожи пациентов, может помочь ученым лучше понять, как опухоли распространяются по телу. Команда также назвала интерстиций недавно обнаруженным органом, но многие отвергли это утверждение. «Большинство биологов не стали бы называть« органом »микроскопические неровности между тканями, которые содержат жидкость», — сказал в прошлом году агентству The Scientist Анирбан Майтра, патолог из Центра Андерсона Университета Техаса.

laurie o’keefe

Брыжейка: орган?

До недавнего времени среди ученых преобладало мнение, что брыжейка, большой веерообразный слой ткани, удерживающий на месте наш кишечник, состоит из нескольких фрагментов. В 2016 году после изучения брыжейки трупов и пациентов, перенесших операцию, группа исследователей пришла к выводу, что брыжейка на самом деле представляет собой единое целое. Это был не первый случай, когда брыжейка описывалась как непрерывная — в одном из первых изображений структуры Леонардо да Винчи также изобразил ее таким образом.Но в статье 2016 года ученые утверждали, что его непрерывность должна квалифицировать брыжейку как орган. Однако, как и в случае с интерстициумом, другие эксперты возражают против этого утверждения. В обоих случаях «по-видимому, возникло непонимание того, что означает термин« орган », — говорит Нойманн.

laurie o’keefe

Сети кровеносных сосудов в кости

В январе 2019 года ученые описали ранее неизвестную сеть капилляров, которые проходят через кости мышей.В учебниках описываются крупные вены и артерии, выступающие из концов костей, но эта недавно описанная сеть туннелей обеспечивает более быстрый путь для клеток крови, произведенных в костном мозге, для попадания в кровоток. Исследовательская группа также изучила человеческие кости, используя различные методы: фотографируя пациентов, перенесших операцию, проводя МРТ-сканирование здоровой ноги и исследуя извлеченные образцы под микроскопом — и выявила аналогичную, хотя и менее обширную, систему капилляров.

laurie o’keefe

Рептилоидные мышцы у зародыша

В октябре прошлого года исследователи сообщили, что мышцы, обычно встречающиеся у рептилий и других животных, но не у людей, присутствуют на конечностях человеческих эмбрионов.Используя комбинацию иммуноокрашивания, очистки тканей и микроскопии, команда создала трехмерные изображения с высоким разрешением мышц верхних и нижних конечностей в образцах тканей сохраненных 8-14-недельных эмбрионов и плодов. Авторы предполагают, что эти структуры, которые исчезают до рождения, могут быть анатомическими остатками наших эволюционных предков, которые исчезают на ранних стадиях развития. Однако они изучили только 13 изображений, поэтому эксперты предупреждают, что это предварительный результат, который необходимо воспроизвести на более крупной выборке.

ЛОРИ О’КИФ

Фабелла возвращается

Фабелла, крошечная кость, расположенная в сухожилии за коленом, становится все более распространенным явлением у людей, согласно исследованию, опубликованному прошлой весной. После обзора 58 исследований распространенности фабеллы в 27 разных странах, исследователи сообщили, что в 2018 году вероятность возникновения косточки у людей была примерно в 3,5 раза выше, чем в 1918 году. Причина этой тенденции остается открытым вопросом, но авторы предполагают, что изменения в мышцах масса и длина костей, обусловленные повышением качества диеты во многих частях мира, могут быть одним из объяснений.

Диана Квон — журналист-фрилансер из Берлина. Следуйте за ней в Twitter @DianaMKwon .

Трансплантация аутологичных стволовых клеток — Тип

Трансплантация аутологичных стволовых клеток

Трансплантация аутологичных стволовых клеток использует здоровые стволовые клетки крови из вашего собственного тела для замены больного или поврежденного костного мозга. Трансплантация аутологичных стволовых клеток также называется трансплантацией аутологичного костного мозга.

Использование клеток вашего собственного тела во время трансплантации стволовых клеток дает некоторые преимущества по сравнению со стволовыми клетками от донора. Например, вам не нужно беспокоиться о несовместимости между донорскими клетками и вашими собственными клетками, если у вас трансплантация аутологичных стволовых клеток.

Трансплантация аутологичных стволовых клеток может быть вариантом, если ваш организм производит достаточно здоровых клеток костного мозга. Эти клетки можно собрать, заморозить и сохранить для дальнейшего использования.

Почему это делается

Аутологичные трансплантации стволовых клеток обычно используются у людей, которым для лечения своих заболеваний требуется пройти курс химиотерапии и облучения в высоких дозах.Эти методы лечения могут повредить костный мозг. Пересадка аутологичных стволовых клеток помогает заменить поврежденный костный мозг.

Для лечения чаще всего используется трансплантация аутологичных стволовых клеток:

• Лимфома Ходжкина
• Миелома
• Неходжкинская лимфома
• Нарушения плазматических клеток

Чего вы можете ожидать

Для проведения трансплантации аутологичных стволовых клеток необходимо:

• Прием лекарств для увеличения количества стволовых клеток в крови. Вы будете получать лекарства, которые заставляют ваши стволовые клетки увеличиваться в количестве и перемещаться из костного мозга в кровь, где их можно легко собрать.

• Фильтрация стволовых клеток из крови (аферез). Для сбора стволовых клеток игла вводится в вену на руке, чтобы взять кровь. Машина отфильтровывает стволовые клетки, а остальная кровь возвращается в ваше тело.

  К стволовым клеткам добавляется консервант, а затем они замораживаются и хранятся для дальнейшего использования.

• Проходит курс лечения рака (кондиционирование) в высоких дозах. Во время процесса кондиционирования вы получите высокие дозы химиотерапии или лучевой терапии, а иногда и оба вида лечения, чтобы убить раковые клетки. Какое лечение вы будете проходить, зависит от вашего заболевания и конкретной ситуации.

  Лечение рака, используемое в процессе кондиционирования, имеет риск побочных эффектов. Поговорите со своим врачом о том, чего вы можете ожидать от лечения.